豬苓硒多糖連續合成工藝及抑菌性能研究

李志洲 劉軍海 王俊宏 鄧百萬 李麗華

（1.陜西理工學院化學與環境科學學院，陜西 漢中 723000；2.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000）

豬苓（Polyporus um bellatus（pers.）fries），又名豬茯苓，屬于無隔擔子菌綱、無褶菌目、多孔菌科、多孔菌屬。豬苓味甘、氣淡、性平，歸腎、膀胱經，有利水滲濕之功效［1］。研究［2］表明，豬苓除了有利尿的作用外還有抗衰老、抗腫瘤、保肝、免疫調節、抗輻射、抗誘變和抗菌等藥理作用；豬苓中主要活性成分豬苓多糖是一種非特異性細胞免疫刺激劑，具有抗衰老、提高免疫力、治療乙型肝炎及抗腫瘤等作用。豬苓的藥用價值越來越受到人們的重視。

微量元素硒是生命體活動的重要活性元素之一，主要以有機硒的形態存在。研究資料［3－7］表明，無機硒因具有蓄積毒性和致突變等作用，且使用時劑量因生命體自身特征差異等難以控制，使得硒的應用受到很大限制；而有機硒卻相反，毒性低、對生命體副作用小，不但可以更好地發揮硒的作用，而且在激發免疫反應上比無機硒更顯著；多糖也是生命體活動的重要活性成分之一，如將無機硒與多糖有機結合使之轉化為有機硒化合物——硒多糖，不僅會使硒和多糖的生理和藥理功能得到優化，更易于為機體吸收和利用。目前硒多糖的制備主要通過以下3種方法來獲得［4，5］：① 生物轉化法；② 化學合成法［8，9］；③ 從天然富硒產物中提取。從目前已有的富硒多糖的研究成果［10，11］看，其工藝大多采用間歇式，生產周期長，原料耗損大，經濟成本高。本課題采用化學合成法，通過連續式合成的工藝設計，研究豬苓硒多糖連續合成的工藝條件，并對合成的產品進行抑菌性能研究，旨在為豬苓硒多糖規模化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

豬苓多糖：參考文獻［12］制備。

純凈水：漢中天露純凈水廠；

乙醇、亞硒酸鈉、無水乙醇、鄰苯二銨、乙二胺四乙酸二鈉、濃鹽酸、氯化鋇、濃硝酸：分析純，西安化學試劑廠；

大 腸 桿 菌 （Escherichia coli）、 金 黃 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：陜西省防漢中市防疫站提供。

1.2 主要儀器

紫外分光光度計：Cary－50型，美國瓦里安中國有限公司；

離心機：LD5－10型，北京京立儀器有限公司；

超聲清洗儀：LC－300B型，山東濟寧魯超超聲設備有限公司；

隔水式電熱恒溫培養箱：BG－50型，上海昨非實驗室設備有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW－D－4型，上海科恒實業發展有限公司；

霉菌培養箱：MHP－250型，上海三發科學儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG－9070A型，上海精宏實驗設備有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LS－C50L型，南昌高騰科技有限公司；

醫用工作臺：YJ型，上海將來實驗設備有限公司；

旋渦混合儀：QT－1型，上海琪特分析儀器系統有限公司；

電子分析天平：FA2204B型，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豬苓硒多糖的分析與合成

（1）硒標準曲線：參照文獻［13］所述方法，分別配制濃度為4，20，36，52，68，84，100，116μg／mL的亞硒酸鈉標準溶液25mL，各取10mL，用1mol／L的 HCl溶液調pH至2，再加5%的EDTA溶液2mL和1%鄰苯二胺試液2mL，振搖，放置2h。取10mL純凈水添加 HCl調pH至2，加2mL鄰苯二銨搖勻后作為參比液。待顯色完全后，取標準液1mL用紫外可見分光光度計在335nm處測定其吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程：

式中：

x—— 亞硒酸鈉的濃度，μg／mL；

y—— 吸光度。

（2）豬苓硒多糖配合物制備流程：將豬苓多糖與氯化鋇混合液（濃度均為0.2mg／mL）和亞硒酸鈉溶液（濃度為0.2mg／mL）連續加入反應器中，加入一定量的濃硝酸，控制反應條件進行豬苓硒多糖的配合反應，反應液通過泵打入截留分子量為10 000的中空膜分離裝置進行濃縮，濃縮液加入無水乙醇使得混合液中乙醇濃度達80%（V／V），醇析，并靜置30min，離心過濾，將所得濾渣烘干，得到產品。

（3）樣品中硒含量的測定：待反應穩定后，精密量取反應器流出溶液100mL，加入無水乙醇調節乙醇濃度為90%，使溶液中硒多糖及未反應多糖絮凝，沉降30min后離心，將沉淀物用95%乙醇溶液洗滌3次，每次20mL，棄去洗滌液，沉淀物用蒸餾水溶解并定容至100mL，取10mL溶液用1mol／L的 HCl溶液調pH至2，再加5%的 EDTA溶液2mL和1%鄰苯二胺試液2mL，振搖，放置2h；以10mL純凈水作同樣操作后作為參比液。用紫外分光光度法在波長為335nm處分別測其吸光度，利用標準曲線的回歸方程進行計算得到硒濃度。然后按式（2）計算合成率：

式中：

y—— 合成率，mg／g；

c1—— 取樣中硒的濃度，mg／mL；

c2——根據兩股原料液流量配比將豬苓多糖折合為反應釜中豬苓多糖的濃度，mg／mL；

v—— 取樣體積，mL；

n——稀釋的倍數。

1.3.2 抑菌活性研究方法 采用濾紙片法測定［14］。

（1）培養基的制備：按參考文獻［14］所述方法制備細菌、真菌和酵母菌種的培養基。

（2）菌懸液的制備：將4種供試菌種分別接入對應的斜面培養基進行活化，操作條件：細菌置于37℃恒溫培養箱中活化24h，真菌和啤酒酵母置于28℃恒溫培養箱中活化48h。精挑菌苔于9mL無菌生理鹽水中，振蕩搖勻，制成一系列菌懸液（106～108CFU／mL 的菌懸液［15］），備用。

（3）豬苓多糖及其硒多糖供試液的制備：精密稱取兩種多糖各2.5g，加蒸餾水溶解并定容至50mL，120℃滅菌20min，冷卻后作為貯備液于4℃冰箱中保存，備用。取14支干燥無菌帶有棉塞的5mL的小試管，分兩組，每組7管；在無菌條件下每管加入1mL無菌蒸餾水，然后取豬苓硒多糖貯備液1mL加入第1管中，搖勻，吸取1mL加入第2管中，依次稀釋至第6管，將6管中多余的1mL溶液棄去，第7支試管作為空白對照管，分別得到濃度為25，12.5，6.25，3.125，1.563，0.781mg／mL的豬苓硒多糖供試液；另7管用來制備豬苓多糖供試液，其制備方法類同。

（4）濾紙片的制備：將定性濾紙用打孔器加工成直徑為6mm的圓形紙片，置入干燥的平皿中干熱滅菌30min后，再浸入豬苓多糖和豬苓硒多糖的供試液中浸泡30min，使其充分吸收。

（5）抑菌試驗：將固體培養基熔化倒入平皿，冷卻待凝固后，分別加入0.2mL供試菌液，均勻涂布，做成含菌平板；用滅菌鑷子夾出含有多糖的濾紙片置于培養基上，平均每皿貼4片，每種菌株做6次重復。細菌置37℃恒溫培養箱中倒置培養24h，霉菌及釀酒酵母置28℃恒溫培養箱中培養48h，取出，測量濾紙片測定抑菌圈的直徑大小，比較抑菌效果，確定最適抑菌濃度。并以無抑菌圈或抑菌效果不明顯（D＜6.20mm）對應的稀釋濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

2 結果與討論

2.1 連續式反應工藝的設計

本試驗設計的連續式反應流程見圖1。

圖1 連續式反應系統示意圖Figure 1 The schematic diagram of homemade continuous reaction system

2.2 硒多糖的合成

2.2.1 單因素試驗結果及其分析 影響豬苓硒多糖合成率的因素很多，如豬苓多糖進料流量、硝酸量、反應溫度、反應物配比、超聲波頻率、多糖濃度、亞硒酸鈉濃度、氯化鋇的加入量等，經初步試驗，前4個因素為主要影響因素，為此本試驗對豬苓多糖硒配合物的合成進行單因素試驗。

（1）進料流量對硒多糖的影響：在5L純凈水中，加入1g豬苓多糖和1g氯化鋇（BaCl2在合成反應中起著催化作用［8］），配制濃度均為0.2mg／mL的豬苓多糖和氯化鋇溶液，配制濃度為0.2mg／mL的亞硒酸鈉溶液1L。亞硒酸鈉溶液與多糖溶液流量比為0.5∶1，反應釜溶劑和多糖與亞硒酸鈉溶液配比的加入流量總和800mL，調整硝酸加入量，使得反應釜中硝酸濃度為0.004mL／mL，超聲輔助合成頻率30kHz，合成溫度30℃，選擇進料流量分別為10，20，30，40，50mL／min，進行單因素試驗，結果見圖2。

圖2 多糖進料流量對硒多糖合成率的影響Figure 2 Effects of polysaccharide feed flow on the Synthesis rate of Se－polysaccharide

由圖2可知，當流量為30mL／min時，試驗測得每克多糖中配合的硒離子含量最大，即合成率最大，且隨著流量增加，合成率呈增大趨勢，但當流量超過30mL／min時，硒多糖的合成率開始下降。究其原因，當流量小時，反應釜中多糖濃度不高，而亞硒酸鈉溶液中的硒離子基本不變，多糖分子與亞硒酸根離子配位合成率隨著多糖分子濃度的增加而增加；當多糖分子濃度超過一定值后，其分子與亞硒酸根離子配位競爭加劇，在催化作用下多糖分子與硒離子配位主要出現在多糖分子鏈的部分官能團附近，導致合成率反而下降，故多糖流量以30mL／min為較佳的流量。

（2）硝酸用量對硒多糖的影響：固定多糖、氯化鋇、亞硒酸鈉濃度均為0.2mg／mL，多糖液進料流量為30mL／min、亞硒酸鈉溶液與多糖溶液流量比為0.5∶1、超聲輔助合成頻率30kHz、合成溫度30℃，反應釜溶劑和多糖與亞硒酸鈉溶液配比的加入流量總和800mL，調整硝酸量加入量，使得反應釜 中 硝 酸 濃 度 分 別 為 0.002，0.004，0.006，0.008，0.01mL／mL，進行單因素試驗，結果見圖3。

圖3 硝酸用量對硒多糖合成的影響Figure 3 Effects of nitric acid on the synthesis rate of Se－polysaccharide

由圖3可知，當硝酸濃度為0.008mL／mL時，合成率最大，此后隨著反應釜中硝酸濃度的增加合成率下降。究其原因，當反應釜中硝酸濃度較小時，隨著硝酸量的增加，溶液中多糖分子中硒化部位的官能團能量下降，使得反應速率加快，豬苓多糖硒絡合物合成率增大；而當硝酸過量時，因為酸度過大可能會影響豬苓多糖上的羥基與亞硒酸酯化，同時也會使多糖分子進一步水解，硒化作用減弱，合成率下降。故硝酸加入量以0.008mL／mL為益。

（3）反應溫度對硒多糖的影響：固定多糖、氯化鋇、亞硒酸鈉溶液的濃度為0.2mg／mL，多糖進料流量為30mL／min、亞硒酸鈉溶液與多糖溶液流量比為0.5∶1、反應釜中硝酸濃度0.008mL／mL，超聲輔助合成頻率30kHz，選擇反應溫度分別為30，40，50，60，70℃，進行單因素試驗，結果見圖4。

圖4 反應溫度對硒多糖合成的影響Figure 4 Effects of reaction temperature on the synthesis rate of Se－polysaccharide

由圖4可知，硒多糖合成率隨著反應溫度的增加先增加后減小，當溫度為60℃時合成率最大。究其原因是因為溫度升高，分子熱運動增加，多糖分子與亞硒酸根離子碰撞幾率增加，反應更為充分，合成率提高；但是溫度過高時，亞硒酸根離子運動過于劇烈，而多糖分子熱運動相對下降，不利于反應的進行，合成率下降；另外溫度升高會導致豬苓多糖的水解，更不利于多糖的硒化。因此，反應溫度以60℃為宜。

（4）反應物配比對合成率的影響：固定多糖、氯化鋇、亞硒酸鈉溶液的濃度均為0.2mg／mL，多糖進料流量為30mL／min，設定反應溫度60℃、反應釜中硝酸濃度0.008mL／mL，超聲輔助合成頻率30kHz，改變亞硒酸鈉溶液流量，使其與多糖溶液流量配比分別為0.5∶1，1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1，進行單因素試驗，結果見圖5。

由圖5可知，硒多糖合成率隨著反應物配比的增加先增加后大幅減小，當配比為1∶1時合成率最大。究其原因，當反應物配比偏小時，反應比較完全，豬苓多糖分子與硒離子碰撞機率高，合成率增大；當反應釜中亞硒酸根離子濃度偏大時，因多糖分子離子效應弱，而亞硒酸根離子離子效應強，配位合成競爭加劇，合成率反而下降。因此反應物配比以1∶1為宜。

2.2.2 正交試驗結果與分析 在單因素試驗的基礎上，對多糖進料流量、反應釜中硝酸濃度、反應溫度、反應物流配比4個因素進行L9（34）正交試驗，因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

圖5 反應物配比對硒多糖合成的影響Figure 5 Effects of liquid ratio on the synthesis rate of Se－polysaccharide

表1 因素水平表Table 1 The table of factors and levels

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments

由表2可知，影響豬苓多糖硒配合物的諸因素的主次關系為多糖進料流量＞反應物配比＞硝酸濃度＞反應溫度，最佳合成條件為多糖進料流量30mL／min，反應物配比1∶1，反應 溫 度70 ℃，硝 酸 濃 度0.008mL／mL，亞 硒 酸 鈉0.2mg／mL，超聲輔助合成頻率30kHz，在此最佳條件下進行驗證性實驗3次，其平均合成率達26.5mg／g，即每克多糖中可配合26.5mg硒。

2.3 豬苓多糖與硒多糖抑菌性能試驗

由表3可知，豬苓多糖及其硒多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和黑曲霉抑菌作用存在差異，豬苓多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯，而豬苓硒多糖對4種菌株的抑菌性能均明顯。表明豬苓硒多糖的抑菌性能優于豬苓多糖。豬苓多糖及其硒多糖配合物對4種供試菌的最佳抑菌濃度見表4。

表3 兩種多糖的抑菌圈直徑表?Table 3 Antimicrobial ring diameter of different bacteria inhibited by two kinds Polysaccharide

表4 兩種多糖的最佳抑菌濃度Table 4 The optimum inhibitory concentration of two kinds Polysaccharide ／（mg·mL－1）

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和啤酒酵母為供試菌，研究豬苓多糖及其硒多糖的最低抑制濃度，以抑菌圈直徑D＝6.2mm為最低抑制效果區，結果見表5。

表5 兩種多糖的最低抑菌濃度MICTable 5 MIC of two kinds Polysaccharide to different bacteria ／（mg·mL－1）

3 結論

（1）在超聲波輔助作用下，對豬苓多糖液與催化劑氯化鋇濃度和亞硒酸鈉溶液的濃度均為0.2mg／mL來說，連續式合成豬苓硒多糖的最佳工藝條件為多糖進料流量30mL／min，亞硒酸鈉溶液與豬苓多糖溶液流量配比1∶1，反應溫度70℃，反應釜內硝酸的濃度0.008mL／mL，超聲輔助合成頻率30kHz，其合成率達26.5mg／g，即每克多糖中可配合26.5mg硒。

（2）豬苓多糖及其硒多糖配合物的抑菌性能研究表明，豬苓多糖及其硒多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母和黑曲霉抑菌作用存在差異，豬苓多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯，而豬苓硒多糖對4種菌株的抑菌性能均明顯；豬苓多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉的最佳抑菌濃度分別為 10.0，2.5，10.0，10.0mg／mL，而其最低抑菌濃度則分別為2.500，1.225，2.500，5.000mg／mL；豬苓硒多糖對4種菌株的最佳抑菌濃度分別為2.5，2.5，5.0，2.5mg／mL，而其最低抑菌濃度則分別為1.225，0.613，2.500，1.225mg／mL，數據顯示，豬苓硒多糖的抑菌性能優于豬苓多糖。

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