上調Delta-Like1基因可增強小細胞肺癌化療敏感性

劉換新 彭娟 白義鳳 郭琳瑯

小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)的細胞倍增時間短,病情進展快,早期即發生血道和淋巴道轉移,惡性程度在所有肺癌類型中最高.SCLC的治療以放化療為主,盡管80%患者早期對放、化療呈現出較好的初始反應性,但很快即發生復發或病情進展.局限期患者5年生存率低于30%,廣泛期患者5年生存率僅1%-2%[1].耐藥形成,尤其是多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)的產生是SCLC化療失敗的最重要原因[2,3].因此,化療抗藥性已成為目前SCLC臨床治療急需解決的問題之一.

DLL1(Delta-Like1)為單次跨膜糖蛋白,屬于DSL(Delta, Serrate, Lag-2)蛋白家族,人類DLL1基因定位于染色體6q27,全長3.04 kb中,ORF編碼723個氨基酸,是脊椎動物Notch的兩個配體之一,它與Notch受體結合激活Notch信號通路,決定細胞分化的命運,參與調控許多組織的生長發育.DLL1的細胞內區域與E3泛素連接酶特異結合,使DLL1泛素化和內吞,激活Notch信號通路所必須的結構域[4-6].已有研究[7,8]報道DLL1與腫瘤的生長、分化密切相關,但DLL1對腫瘤耐藥方面的研究還很少見,尤其在SCLC耐藥中的作用目前國內外還未見相關的報道.我們前期通過基因表達譜芯片對SCLC耐藥細胞H69AR和非耐藥細胞H69中21,522個基因進行分析,結果發現H69AR細胞中包含DLL1在內的1,131個基因表達下調[9],1,252個基因表達上調,本實驗旨在進一步驗證DLL1在SCLC敏感細胞株H69和多藥耐藥株H69AR中的表達,以及其表達對SCLC化療藥物敏感性及細胞周期與凋亡的影響.

1 材料與方法

1.1 材料 pIRES2-EGFP質粒、感受態細菌為本實驗室保存.人SCLC敏感細胞株(H69)和其阿霉素耐藥株(H69AR)均購自美國ATCC,新生胎牛血清、RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司;順鉑、阿霉素和依托泊苷購自輝瑞公司;CCK8及凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司;第1鏈cDNA合成試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、DNA maker、DNA純化試劑盒、質粒提取試劑盒、反轉錄試劑盒、限制性內切酶等購自大連寶生生物公司;脂質體Lipofetamine 2000購自Invitrogen公司;兔抗人單克隆抗體DLL1購自美國Santa Cruz公司;羊抗兔二抗購自武漢博士德生物公司.

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR分析DLL1及其下游基因的mRNA表達 提取細胞中的總RNA進行逆轉錄和實時熒光定量PCR.使用SYBR實時定量反應試劑盒(Takara)對實驗組和對照組細胞中的DLL1基因及其下游基因的表達進行分析.Real-time PCR反應及數據分析在ABI PRESM 7500實時定量反應儀上完成,引物由Takara公司合成.DLL1 Forward:AGGGTGTGATGACCAACATGGA;DLL1 Reverse:ATCGGATGCACTCATCGCAGTA;HES 1 Forward:AAAGACGGCCTCTGAGCAC;HES1 Reverse:GGTGCTTCACAGTCATTTCCA;HEY1 Forward:CATGAAGAGAGCTCACCCAGA;HEY1 Reverse:CGCCGAACTCAAGTTTCC;內參照GAPDH上游引物為5'-GGAAGGACTCATGACCACAGTCC-3',下游引物為5'-TC GCTGTI'GAAGTCAGAGGAGACC-3'.逆轉錄反應及PCR參照試劑盒說明,以DLL1及其下游基因的上下游引物進行PCR擴增,PCR反應在實時定量PCR反應儀上進行.3次獨立實驗后得到的數據運用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進行分析.

1.2.2 過表達pIRES2-EGFP-DLL1的轉染及穩定轉染細胞株的篩選 ①轉染前1天,胰酶消化H69AR細胞并計數,細胞鋪板,加入含20%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養液,使其在轉染日密度為60%-80%;②在兩個無菌的Eppendoff管中,分別將1 μL純化的質粒pLEGFP-N1-DLL1(濃度1 μg/μL)和1 μL純化的質粒pLEGFP-N1(濃度1 μg/μL)空載體質粒,各用50 μL的無血清無抗生素的Opti-MEM進行稀釋、混勻,制成溶液A和B.在另一個Eppendoff管中,將4 μL LipofectamineTM2000用100 μL的無血清無抗生素的Opti-MEM進行稀釋、混勻,制成溶液C.在5 min內將A和50 μL C、B和50 μL C混勻,室溫靜置20 min;③等待期間,將培養板中的H69AR細胞用無血清的RPMI-1640培養液洗滌3次,加入400 μL無血清無抗生素的Opti-MEM培養基;④將AC、BC混合物加于H69AR細胞表面,輕輕來回晃動培養板,使混合物均勻覆蓋于細胞表面,37oC、5%CO2孵育;⑤6 h后吸去培養液,將細胞用新鮮的培養液洗滌2次,加入含20%胎牛血清的無抗生素的RPMI-1640培養基繼續培養.轉染48 h后熒光顯微鏡下觀察熒光強度,檢測轉染效率;⑥第2天細胞按1:8傳代,正常培養基培養;⑦第3天培養基換成含篩選濃度(400 μg/mL)的G418的10%胎牛血清RPMI-1640培養基進行篩選培養;⑧3周后待形成陽性單細胞克隆群落后,用尖吸管吸取單克隆陽性細胞培養,改用含半濃度G418(200 μg/mL)的培養基擴大培養.

1.2.3 Western blot分析DLL1蛋白表達 提取細胞總蛋白,BCA法蛋白定量,每孔中加樣50 μg蛋白,經10%SDSPAGE后,電轉移至PVDF膜.5%BSA/TBST室溫封閉1 h,加入兔抗人DLL1單克隆(1:200)孵育,4oC過夜.TBST漂洗3次,用 HRP標記的羊抗兔IgG(1:5,000)孵育,室溫2 h,TBST漂洗3次,ECL檢測,暗室曝光10 s-10 min,顯影.

1.2.4 CCK8法檢測藥物敏感性 參照順鉑(DDP)、足葉乙苷(VP-16)及阿霉素(ADM)3種化療藥物的血漿高峰濃度,在各種轉染細胞中分別加入0.01倍、0.1倍、1倍和10倍血漿高峰濃度的化療藥物,每種藥物的每一濃度設4個重復孔;陰性對照組:僅加細胞不加藥物,設 4個重復孔;空白調零組:僅加細胞培養液,設4個重復孔.以每孔3X103個細胞接種于96孔培養板中,每孔加入200 μL培養液;細胞貼壁后,將3種化療藥物按不同濃度加入各孔細胞,繼續常規培養24 h;每孔加新鮮配制的CCK8溶液20 μL,37oC、5%CO2下繼續培養0.5 h-4 h后,終止培養.選擇450 nm波長,在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值,取每4個重復孔的光吸收值(A值)的平均值,計算各種轉染細胞在3種化療藥物不同濃度下的存活率;細胞存活率=(實驗組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)X100%.重復實驗3次,取平均值,以細胞存活率為縱軸,藥物濃度對數為橫軸作半對數圖,并按作圖法求出3種藥物的IC50值.

1.2.5 細胞凋亡檢測 對數生長期的細胞以 4X105/孔接種6孔板中;37oC培養48 h;收集細胞,PBS洗滌2次;細胞重懸于100 μL含Annexin V-FITC和0.5 μg PI的結合緩沖液(10 mM HEPES pH7.4; 0.15 M NaCl; 5 mM KCl; 1 mM MgCl2; 1.8 mM CaCl2)中;避光室溫孵育15 min;加入400 μL結合緩沖液;流式細胞儀分析.

1.2.6 細胞周期檢測 取對數生長期的細胞,用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化細胞,PBS洗2次,用75%乙醇冰浴固定24 h,然后用含1%BSA的PBS充分混勻洗滌2次,PI染色后進行流式細胞儀測定并用Cell Quest軟件分析各組細胞群體在細胞周期各個時相的分布比例.

1.3 統計學方法運用SPSS 13.0統計軟件分析,采用t檢驗或One-way ANOVA檢驗,P<0.05為差異具有統計學意義.

2 結果

2.1 DLL1在敏感株(H69)和耐藥株(H69AR)中的差異表達 如圖1A所示,qRT-PCR結果顯示H69AR細胞株中DLL1 mRNA表達較H69細胞降低,差異具有統計學意義(P=0.003).Western blot結果也顯示在耐藥株H69AR中的DLL1蛋白的表達較敏感株H69明顯降低(圖1B,P<0.001).通過PIRES2-EGFP-DLL1上調H69AR細胞株中DLL1的表達:如圖2所示,H69AR分別轉染PIRES2-EGFP-NC(A)及PIRES2-EGFP-DLL1(B)后48 h,通過熒光顯微鏡觀察其轉染效率達80%(圖2A,圖2B).QRT-PCR和Western blot檢測轉PIRES2-EGFP-DLL1后,DLL1在mRNA和蛋白水平上均增高(圖2C,圖2D,P=0.004),差異具有統計學意義.提示過表達DLL1的穩定細胞株H69AR-eGFP-DLL1構建成功.細胞對化療藥物敏感性的變化:如圖3所示,CCK8檢測顯示H69AR對順鉑(DDP),阿霉素(ADM)及足葉乙苷(VP-16)的IC50值較敏感細胞株H69增高,提示H69AR對化療藥物的敏感性降低(圖3A,P=0.009).通過轉染PIRES2-EGFP-DLL1上調H69AR細胞株中DLL1的表達后,與對照組(H69AR及H69AR-PIRES2-EGFP-NC)相比細胞對DDP,ADM及VP-16的敏感性明顯增加,差異具有統計學意義(圖3B,P=0.016).

表 1 上調DLL1的表達后細胞凋亡率的變化(%, Mean±SD, n=5)Tab 1 The apoptosis rate of cells was assayed after transfected with eGFP-DLL1 or a negative control (NC) (%, Mean±SD, n=5)

2.2 細胞凋亡率的變化 如表1及圖4所示,流式細胞技術檢測顯示,上調DLL1表達后,H69組凋亡率為(7.294±0.389)%(圖4A),H69AR細胞的凋亡率為(1.954±0.088)%(圖4B),H69AR的凋亡率明顯低于H69,兩組之間差異具有統計學意義(P<0.001).而H69AR轉染PIRES2-EGFPDLL1(圖4D)后凋亡率為(17.202±0.872)%較H69AR組及轉染PIRES2-EGFP-NC(2.112±0.222)%(圖4C)組明顯增高,差異具有統計學意義(P<0.001).結果提示上調DLL1明顯增加H69AR細胞的凋亡.

2.3 細胞周期的變化 流式細胞技術檢測顯示,H69組細胞周期主要以G0/G1期為主(圖5A),H69AR細胞G2/M期細胞增多(圖5B),H69AR的G2/M期細胞明顯較H69細胞增多,兩組之間差異具有統計學意義(P<0.01).而H69AR轉染PIRES2-EGFP-DLL1(圖5D)后細胞周期G0/G1期及S期細胞較H69AR組及轉染PIRES2-EGFP-NC(圖5C)組明顯增高(P<0.001).結果提示上調DLL1使細胞周期發生G0/G1期和S期阻滯(表2).

2.4 DLL1對下游靶基因的激活 為進一步研究DLL1影響小細胞肺癌耐藥的分子機制,我們通過qRT-PCR從基因水平檢測了DLL1下游基因的表達,如圖6所示,上調DLL1的表達,下游靶基因HES1及HEY1的表達升高,提示DLL1對下游靶基因HES1及HEY1有激活作用.DLL1下游基因HES1、HEY1的激活可能是通過腫瘤細胞之間的受體--配體相互作用的結果.

3 討論

圖 1 qRT-PCR和Western blot在mRNA水平(A)和蛋白水平(B)檢測H69及H69AR細胞中DLL1的表達. **P<0.01.Fig 1 The expression of DLL1 mRNA (A) and protein (B) levels were assessed by qRT-PCR and Western blot in H69 and H69AR cells. **P<0.01.

圖 2 轉染PIRES2-EGFP-DLL1過表達質粒上調DLL1的表達.H69AR分別轉染PIRES2-EGFP-NC(A)及PIRES2-EGFP-DLL1(B)后48 h,通過熒光顯微鏡觀察其轉染效率.細胞轉染PIRES2-EGFP-DLL1后,在mRNA水平(C)和蛋白水平(D)檢測其對DLL1的表達.光鏡,200X(左);熒光顯微鏡,200X(右).**P<0.01.Fig 2 eGFP-NC (negative vector) and eGFP-DLL1 overexpression plasmid were transfected into H69 cells. At 48 h after transfection, uorescent microscopy showed emission green uorescence to detect the transfection efficiency. (A) PIRES2-EGFP-NC; (B) PIRES2-EGFP-DLL1. The expression of DLL1 mRNA (C) and protein (D) after transfected with PIRES2-EGFP-DLL1. Left: Light microscopy, 200X; Right: Fluorescent microscopy, 200X.**P<0.01.

表 2 過表達DLL1后細胞周期分布的百分數(%,Mean±SD,n=3)Tab 2 The cell cycles distribution were detected after transfected with eGFP-DLL1 or a negative control (NC) (%, Mean±SD, n=3)

圖 3 細胞對化療藥物的敏感性的變化.A:CCK8檢測H69和H69AR細胞對化療藥物DDP、ADM及VP-16的敏感性;B:通過轉染PIRES2-EGFP-DLL1上調H69AR中DLL1的表達后,細胞對DDP、ADM及VP-16的敏感性明顯增加.*P<0.05.Fig 3 The sensitivities of cells to chemotherapy drugs. A: The sensitivities of cells to chemotherapy drugs (ADM, DDP and VP-16) were measured in H69 and H69AR cells; B: The sensitivities of cells to chemotherapy drugs (ADM, DDP and VP-16) were measured after H69AR cells transfected with PIRES2-EGFP-DLL1 or mock by CCK-8 assay. DDP: cis-platinum; ADM: adriamycin; VP-16: etoposide; IC50 value: half maximal inhibitory concentration.

圖 4 上調DLL1的表達后流式細胞術檢測細胞凋亡的變化.A:H69;B:H69AR;C:H69AR-EGFP-NC;D:H69AR-EGFPDLL1.Fig 4 Cell apoptosis was assayed by flow cytometric analysis after transfected with eGFP-DLL1 or a negative control (NC). A: H69; B: H69AR; C: H69AR-EGFP-NC; D:H69AR-EGFP-DLL1.

圖 5 上調DLL1的表達后流式細胞術檢測細胞周期的變化.A:H69;B:H69AR;C:H69AR-EGFP-NC;D:H69AR-EGFP-DLL1.Fig 5 Cell cycles were assayed by flow cytometric analysis after transfected with eGFP-DLL1 or a negative control (NC). A: H69; B: H69AR; C: H69AREGFP-NC; D: H69AR-EGFP-DLL1.

圖 6 qRT-PCR檢測DLL1下游基因的表達Fig 6 The expression of DLL1 downstream genes HES1 and HEY1 were detected by qRT-PCR

Notch信號通路是進化上高度保守的細胞與細胞間的信號傳導系統,與細胞增殖、分化及凋亡密切相關[10,11],在胚胎正常發育、機體穩態調控以及成體干細胞的維持中發揮重要作用,該通路的異常激活不僅直接參與腫瘤的發生發展,還與腫瘤耐藥密切相關[12-14].近年來的研究[15-17]發現Notch-1廣泛表達于多種腫瘤細胞,通過促進上皮間質轉換(epithelial-mesen chymal transition, EMT)、腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSC)表型的改變和調節微小RNA(microRNAs, miRNA)等途徑,導致腫瘤對多種化療藥物產生抗藥性.因此,Notch-1是對抗腫瘤耐藥的潛在靶點.還有研究[18-23]表明Notch1受體及其配體deltalike-1(DLL1)在腫瘤的生長、分化、增殖及凋亡中發揮著重要的作用.目前共發現了5種人的Notch配體,分別是DLL1、Delta-like-3(DLL3)、Delta-like-4(DLL4)、JAG1和JAG2.DLL1為單次跨膜糖蛋白,屬于DSL(Delta,Serrate, Lag-2)蛋白家族成員,作為Notch信號轉導通路的配體之一,目前已有相關研究[17,18]報道DLL1能夠抑制腫瘤細胞的增殖和促進細胞分化.人類DLL1基因定位于染色體6q27,長度為3.04 kb,其ORF 編碼723個氨基酸,它與Notch受體結合激活Notch信號通路,決定細胞分化的最終歸宿,并參與調控許多組織的生長發育[23,24].DLL1的細胞內區域與E3泛素連接酶特異結合,該過程稱為DLL1泛素化和內吞,此為激活Notch信號通路所必須的結構域[4-6].Notch信號通路正是通過這一機制調控細胞的分化、增殖及凋亡等過程.研究[21]報道,MiR-34a通過靶向作用于Notch的配體DLL1損害CD15+/CD133+腫瘤增殖細胞從而促進髓母細胞瘤的分化.Huang等[7]發現選擇性的刺激DLL1-Notch信號通路能夠恢復T細胞的功能,抑制腫瘤的生長.還有研究[8]發現在B16黑色素瘤細胞中上調Notch配體DLL1的表達引起腫瘤血管的減少而抑制腫瘤的生長.

盡管DLL1與腫瘤的生長及分化方面的研究較多,然而該基因及其編碼的蛋白質與腫瘤耐藥的關系報道很少,與SCLC的多藥耐藥的相關性目前國內外尚未見相關報道.本實驗在前期對SCLC耐藥細胞株和敏感細胞株高通量芯片篩選中發現,H69AR耐藥細胞株中DLL1的表達較敏感細胞株H69明顯降低[9],為了進一步驗證芯片結果,我們運用qRT-PCR和Western blot方法進一步從基因和蛋白水平檢測了SCLC中DLL1的表達,結果和基因芯片的表達一致.同時,我們還發現,在H69AR細胞株中轉染PIRES2-EGFP-DLL1上調DLL1的表達后,腫瘤細胞對化療藥物的敏感性明顯增加,流式細胞儀檢測顯示上調DLL1的表達后細胞凋亡明顯增加,細胞周期阻滯在G0/G1期,提示DLL1與SCLC的耐藥相關,上調DLL1基因的表達可以提高SCLC耐藥細胞株的化療敏感性,DLL1有可能成為治療SCLC的靶標.但其具體的機制尚有待于進一步研究.