MALDI-TOF質(zhì)譜篩查NSCLC患者血清特異性多肽的探索性研究

安娟 湯傳昊 王娜 劉毅 郭萬峰 李曉燕 王子赫 何昆 劉曉晴

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率上升速度高居各種腫瘤之首。據(jù)衛(wèi)生部2008年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年肺癌的發(fā)病人數(shù)約為70萬，2/3的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)。其中，占肺癌80%-90%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者5年生存率僅為8%-15%[1]，但I(xiàn)期肺癌術(shù)后10年生存率可達(dá)到92%[2]。由此可見早診斷早治療是降低肺癌死亡率的關(guān)鍵所在。傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)診斷主要通過影像學(xué)檢查，盡管低劑量螺旋CT的應(yīng)用相比胸部X線片提高了肺癌早診率，死亡率下降了20%[3]，然而，早期肺癌患者體內(nèi)潛在癌變的細(xì)胞克隆遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于現(xiàn)今影像學(xué)測(cè)量技術(shù)可達(dá)的最小閾值，因此有必要尋找更早于影像學(xué)診斷的靈敏性和特異性更高的方法以提高肺癌的早期確診率。腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)從蛋白、肽段等更微觀的角度研究腫瘤，尋找腫瘤標(biāo)志蛋白，進(jìn)而闡明其表達(dá)水平的變化與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相互關(guān)系，在腫瘤早期診斷中極具潛力。其核心技術(shù)質(zhì)譜分析近年已逐漸應(yīng)用于乳腺癌、胃癌、大腸癌等惡性腫瘤早期診斷的探索性研究[4-6]。本研究旨在應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionizationtime of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）與納米磁珠提取血清多肽方法相結(jié)合--ClinProtTM系統(tǒng)，探索性分析NSCLC患者與健康人群的血清，從中篩選差異性多肽，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法建立診斷NSCLC的分類模型并進(jìn)行驗(yàn)證，以期為建立NSCLC血清學(xué)診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源與收集 共收集了2011年8月-2012年10月在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院肺部腫瘤科就診，經(jīng)病理證實(shí)為NSCLC的患者的血清標(biāo)本（以下簡(jiǎn)稱肺癌組）133例，所有病例均經(jīng)臨床檢查排除重要臟器（心、肝、腎等）疾病，血清標(biāo)本在患者未進(jìn)行任何治療時(shí)采集。同期收集了來自門診體檢正常的健康者的血清標(biāo)本（以下簡(jiǎn)稱健康組）132例，所有健康者肺部專科檢查無異常，既往無肺部疾病病史。

標(biāo)本收集步驟：①晨起8:00空腹采集外周靜脈全血3 mL置于EDTA抗凝試管；②常溫靜置2 h；③于4oC、1,500 r/min離心10 min；④取上清液（血清），每150 μL分裝一份，-80oC冰箱保存。

1.1.2 入組者基本情況 將133例NSCLC患者和132例健康者血清標(biāo)本分別按3:1的比例隨機(jī)分為兩組：訓(xùn)練組由100例NSCLC患者（以下簡(jiǎn)稱肺癌組I）和100例健康者（以下簡(jiǎn)稱健康組I）血清標(biāo)本組成，用以建立分類模型；測(cè)試組由33例NSCLC患者（以下簡(jiǎn)稱肺癌組II）和32例健康者（以下簡(jiǎn)稱健康組II）血清標(biāo)本組成，用以驗(yàn)證模型。訓(xùn)練組與測(cè)試組患者在年齡、性別、吸煙情況、組織學(xué)類型及臨床分期等方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。患者及健康者基本情況見表1。

1.1.3 試劑和儀器 三氟乙酸（trifluoroacetic acid, TFA）（美國(guó)Sigma公司）；乙腈（acetonitrile，CAN，美國(guó)Fisher公司）；α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA）和混合標(biāo)肽（Bruker公司）；銅離子螯合納米磁珠（MB-IMAC-Cu2+）及其緩沖液體系（國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心）；MALDI-TOF-MS（Ultraflex）、 MTP-Anchorpchip 靶（Var/384）、磁珠分離器（magnetic bead separator, MBS）、分析軟件ClinProTools 2.1均為Bruker公司產(chǎn)品；離心機(jī)（LDZ5-2，北京離心機(jī)廠）。

表 1 患者及健康者基本情況Tab 1 Basic information of patients and healthy human

1.2 磁珠提取血清多肽及質(zhì)譜檢測(cè) 將MB-IMAC-Cu2+混勻，取5 μL磁珠及50 μL結(jié)合液加入Eppendorf管，放在MBS上移動(dòng)4次，棄去上清液，并重復(fù)3次；再加入20 μL結(jié)合液和 5 μL血清，混勻，室溫下靜置10 min，編號(hào)；將Eppendorf管放在MBS上移動(dòng)4次，除去上清液；加入100 μL洗滌液，在MBS上移動(dòng)4次，棄去上清液；再加入100 μL洗滌液，在MBS上移動(dòng)4次，棄去上清液，此步驟重復(fù)2次；加入20 μL洗脫液，混勻，室溫靜置20 min，將Eppendorf管放置在MBS上移動(dòng)4次后靜置20 s，將上清液移至新的Eppendorf管內(nèi)，得到血清多肽，編號(hào)。

將1 μL提取的血清多肽與1 μL飽和HCCA基質(zhì)（用含0.1%TFA、50%CAN溶解）混勻，點(diǎn)在靶板上，室溫干燥；將靶板放入質(zhì)譜儀； 用標(biāo)準(zhǔn)品校正儀器后，檢測(cè)標(biāo)品，獲得由不同質(zhì)荷比（mass-to-charge ratio, m/z）的多肽峰構(gòu)成的質(zhì)譜圖。

為了避免系統(tǒng)誤差以及人為操作的失誤，在每次標(biāo)本檢測(cè)前均會(huì)使用標(biāo)準(zhǔn)品（多肽混合物）進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品組成一致，說明試驗(yàn)系統(tǒng)正常時(shí)才會(huì)進(jìn)行標(biāo)本的檢測(cè)，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠以及可重復(fù)性。

同時(shí)，為了說明系統(tǒng)穩(wěn)定性，隨機(jī)抽取肺癌組和健康組血清標(biāo)本各10例，每例每一次取血清5 μL，用于連續(xù)6天以及1天內(nèi)連續(xù)6次的磁珠提取和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。選取m/z范圍在1,000 Da-10,000 Da的峰計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果顯示日間和日內(nèi)變異系數(shù)均小于20%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 血清多肽經(jīng)MB-IMAC-Cu2+提取后，通過MALDI-TOF-MS進(jìn)行線性模式檢測(cè)，所獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過 ClinProToolTM（CPT）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在用CPT軟件正式分析前先對(duì)樣品原始質(zhì)譜圖進(jìn)行處理，包括基線消減、校正和歸一化。隨后，將作為訓(xùn)練組的100例NSCLC患者和100例健康者的血清多肽譜，用軟件內(nèi)嵌的統(tǒng)計(jì)算法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，獲得兩組間的差異表達(dá)多肽，然后由統(tǒng)計(jì)軟件優(yōu)選出其中3個(gè)多肽（7,478.59 Da、2,271.44 Da、4,468.38 Da）建立診斷NSCLC的分類模型。模型通過分析這3個(gè)多肽在每例標(biāo)本中的峰面積大小，判斷該標(biāo)本來源于肺癌患者或健康者。最后再用測(cè)試組的33例NSCLC患者和32例健康者通過分類模型進(jìn)行盲樣驗(yàn)證，以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)定性和可靠性。

2 結(jié)果

2.1 訓(xùn)練組的血清多肽指紋圖譜 訓(xùn)練組納入100例NSCLC患者和100例健康者，應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)訓(xùn)練組的血清多肽磁珠提取物，得到肺癌組I和健康組I的血清多肽指紋圖譜，結(jié)果見圖1。

2.2 訓(xùn)練組的血清差異多肽結(jié)果分析

2.2.1 肺癌相關(guān)差異表達(dá)多肽的發(fā)現(xiàn) 肺癌組I和健康組I的血清多肽指紋圖譜經(jīng)CPT軟件分析后共鑒定出多肽峰131個(gè)。定義兩組間P＜0.000,001、AUC≥0.9的多肽峰具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，由此找到兩組m/z在1,000 Da-10,000 Da范圍內(nèi)表達(dá)的差異多肽峰14個(gè)，具體結(jié)果見表2。

表 2 訓(xùn)練組差異多肽質(zhì)荷比及表達(dá)變化Tab 2 m/z and expression change of training group

2.2.2 NSCLC分類模型的建立 通過CPT軟件的聚類分析方法（圖2）對(duì)肺癌組I與健康組I的血清多肽指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比分析，得到監(jiān)督神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法（supervised neural network, SNN）為最優(yōu)算法，該算法是以原型為基礎(chǔ)的分組算法，是以Kohonen’s學(xué)習(xí)型向量量化器的觀點(diǎn)為基礎(chǔ)，從監(jiān)督相關(guān)的神經(jīng)氣體算法[7]改進(jìn)而來。其工作方式為：①依據(jù)Batch-Neural-Gas算法將預(yù)先定義的原型（分組）數(shù)分布于數(shù)據(jù)中，進(jìn)而根據(jù)數(shù)據(jù)密度屬性建立原型的最優(yōu)分布；②隨后根據(jù)分組信息優(yōu)化原型數(shù)在數(shù)據(jù)中的分布，同時(shí)將經(jīng)驗(yàn)性錯(cuò)誤最小化。該算法結(jié)果顯示最優(yōu)模版由3個(gè)多肽組成，其質(zhì)荷比分別為7,478.59 Da、4,468.38 Da、2,271.44 Da（圖3）。以該模版建立分類模型，定義當(dāng)某血清多肽圖中其7,478.59 Da峰面積在（3.85±1.42）范圍、4,468.38 Da峰面積在（434.41±157.85）范圍、2,271.44 Da峰面積在（12.01±4.28）范圍時(shí)，該血清來源于肺癌患者；而血清多肽圖中7,478.59 Da峰面積在（11.55±3.78）范圍、4,468.38 Da峰面積在（150.05±51.41）范圍、2,271.44 Da峰面積在（37.7±23.8）范圍時(shí)，該血清來源于健康者。結(jié)果得到該模型對(duì)肺癌的識(shí)別率為98.04%，預(yù)測(cè)能力為99.07%。

2.3 盲法鑒定 對(duì)納入測(cè)試組的33例肺癌患者和32例健康者血清，采取同樣的CPT軟件獲得其血清多肽指紋圖譜，并運(yùn)用SNN算法建立的模型進(jìn)行驗(yàn)證，33例肺癌患者和31例健康對(duì)照被準(zhǔn)確判斷（其中33例肺癌患者全部判斷正確，32例健康者中有1例判斷假陽(yáng)性，其它都判斷正確）。通過盲樣驗(yàn)證，該模型的準(zhǔn)確率為98.5%，特異性為96.9%，敏感性為100%。

3 討論

質(zhì)譜分析是腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)的核心檢測(cè)技術(shù)，目前常用的生物質(zhì)譜包括： MALDI-TOF-MS、電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS）、表面加強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（surface-enhanced laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, SELDITOF-MS）等。其中MOLID-TOF-MS具有耐鹽和耐污染物的能力高、靈敏度高的特點(diǎn)，在儀器中引入反射技術(shù)和延遲提取技術(shù)后，儀器的分辨率大大提高，在測(cè)定2,000 Da左右的小分子多肽時(shí)，準(zhǔn)確度可達(dá)到 10 ppm以下。

圖 1 訓(xùn)練組的血清多肽圖譜。A：肺癌組I；B：健康組I。Fig 1 Serum peptide profiles of training group. A: NSCLC I; B: Healthy I.

圖 2 血清多肽圖的聚類分析（紅色：肺癌組I；綠色：健康組I）Fig 2 Clustering analysis of MS-based serum peptide profiles (red:NSCLC I; green: Healthy I)

圖 3 建模的3個(gè)多肽峰（紅色：肺癌組I；綠色：健康組I）Fig 3 Specific peptide peaks of model (red: NSCLC I;green: Healthy I)

鑒于質(zhì)譜在鑒定蛋白質(zhì)方面具有高敏感、高通量等優(yōu)勢(shì)，近年來很多研究者嘗試通過質(zhì)譜檢測(cè)來早期診斷腫瘤。其主要方法是通過對(duì)腫瘤患者與健康人群的標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)譜分析，從而發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性蛋白或多肽。Monari等[8]用IMAC30-Cu和H50的SELDI芯片對(duì)44例NSCLC患者和19例正常人研究，發(fā)現(xiàn)兩組間存在28個(gè)明顯差異峰，遂建立模型，用IMAC30-Cu芯片得到的敏感性和特異性分別是70.45%和68.42%，而H50芯片分別是72.73%和73.68%。Han等[9]用金屬親和蛋白芯片和SELDITOF技術(shù)研究血清標(biāo)本，利用3個(gè)蛋白質(zhì)建立樹狀模型，盲樣驗(yàn)證敏感性為89%、特異性為91%、準(zhǔn)確率為90%。Hocker等[10]采用ESI-MS對(duì)43例早期NSCLC患者和21例對(duì)照者的血清標(biāo)本進(jìn)行分析，鑒定的差異蛋白區(qū)分患者及健康者血清的總體有效率和靈敏度為80%和84%。這些研究結(jié)果說明質(zhì)譜檢測(cè)方法有能力識(shí)別肺癌患者血清里所含有的腫瘤相關(guān)信息，有可能進(jìn)行肺癌的早期診斷。但上述研究盲樣驗(yàn)證的敏感性和特異性均較低，且沒有后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。分析其原因?yàn)椋孩僭趥鹘y(tǒng)的方法中，無論是雙向凝膠電泳、蛋白芯片還是固相萃取小柱等預(yù)處理技術(shù)提取標(biāo)本中的蛋白和多肽，均存在操作復(fù)雜且提取效率較低的缺點(diǎn)，導(dǎo)致可用信息丟失；②ESI、SELDI-TOF-MS等質(zhì)譜檢測(cè)方法靈敏度和分辨率較低，反映的信息較少。以上限制阻礙了它們?cè)诩膊√禺愋詷?biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和臨床診斷上的應(yīng)用。

為了解決上述問題，本研究組應(yīng)用了德國(guó)布魯克·道爾頓公司研發(fā)的ClinProtTM檢測(cè)系統(tǒng)[11,12]。它包括磁珠分離系統(tǒng)、MALDI-TOF-MS系統(tǒng)、分析軟件和可選的體液樣品自動(dòng)處理系統(tǒng)，其優(yōu)勢(shì)在于：①擁有最新Anchor-Chip專利技術(shù)的樣品靶可大大增加分析物的濃度，較常規(guī)芯片提高10倍-100倍的靈敏度；②MALDI技術(shù)的分辨率與重復(fù)性、重現(xiàn)性均高于SELDI或其它質(zhì)譜技術(shù)；③液體磁珠總表面積大，能充分捕獲血清中特異低豐度多肽信息，提高了模型的特異性和準(zhǔn)確性；④水熱法制備金屬螯合納米磁珠[13]系統(tǒng)配合了一套適合于質(zhì)譜分析的緩沖溶液，整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系穩(wěn)定、可靠，實(shí)現(xiàn)了樣品微量化，分析過程快速化、通量化、標(biāo)準(zhǔn)化。在哈佛大學(xué)女子醫(yī)院、紐約斯隆-凱特琳癌癥研究所、貝勒醫(yī)學(xué)院等世界一流醫(yī)院和醫(yī)學(xué)研究所中，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于卵巢癌、腦膠質(zhì)瘤、頭頸鱗癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌[14,15]等的早期診斷研究中，而在本研究中，我們通過ClinProtTM檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)NSCLC患者和健康者血清進(jìn)行了檢測(cè)，兩組間發(fā)現(xiàn)14個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的多肽峰，遂以統(tǒng)計(jì)軟件篩選出3個(gè)多肽峰建立NSCLC分類模型，并對(duì)其進(jìn)行盲樣驗(yàn)證，其敏感性為100%，特異性為96.9%，準(zhǔn)確率為98.5%，說明我們建立的分類模型理論上具有一定的鑒別NSCLC患者的價(jià)值，但尚需在臨床實(shí)踐中進(jìn)一步證實(shí)。

關(guān)于我們建立的分類模型，它不像傳統(tǒng)診斷模式那樣以單一指標(biāo)為判斷依據(jù)，而是以一組多肽指標(biāo)為判斷標(biāo)準(zhǔn)。它以生物質(zhì)譜技術(shù)為支撐平臺(tái)，生物信息學(xué)為橋梁，對(duì)多肽表達(dá)進(jìn)行研究，通過肺癌患者血液中多肽組的變化，可以發(fā)現(xiàn)特異的腫瘤相關(guān)信息以達(dá)到對(duì)腫瘤的診斷。當(dāng)血液流經(jīng)腫瘤微環(huán)境時(shí)，血清蛋白/多肽組中可能產(chǎn)生許多輕微的未知組分的變化，因此，使用復(fù)合的標(biāo)志物可以較單個(gè)標(biāo)志物更為有效。通過MALDI-TOF分析的血清質(zhì)譜圖需要數(shù)字化并經(jīng)成熟的生物信息工具軟件來診斷分析，通過與機(jī)體在正常條件下的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，從而鑒別腫瘤患者和非腫瘤患者。它可在數(shù)分鐘內(nèi)從微量血液中測(cè)出上萬個(gè)結(jié)果并對(duì)其進(jìn)行分析，理論上這種分類模型在腫瘤診斷中有望超越傳統(tǒng)的標(biāo)志物檢測(cè)。

本研究中建立分類模型的3個(gè)多肽峰，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示其中m/z為2,271.44的多肽峰可能代表間α胰蛋白酶重鏈H4（inter-α-trypsin inhibitor H4, ITIH4）。查閱文獻(xiàn)，間α胰蛋白酶重鏈（inter-α-trypsin inhibitor, ITIH）基因是一種抑癌基因[16]，包括ITIH1-ITIH5，其中ITIH4定位于3號(hào)染色體短臂，對(duì)血漿激肽釋放酶高度敏感，被認(rèn)為是潛在的血漿激肽釋放酶誘導(dǎo)的生物肽前體。它主要在炎癥和癌癥發(fā)生方面起重要作用[17]。有研究[18]發(fā)現(xiàn)ITIH4在卵巢癌血清中表達(dá)下降。也有研究[19,20]認(rèn)為ITIH4是乳腺癌的腫瘤標(biāo)志物，在乳腺癌患者血清中表達(dá)上調(diào)，有助于診斷和判斷預(yù)后 。但有關(guān)肺癌的報(bào)道較少，Hamm等[17]發(fā)現(xiàn)在52%的肺癌組織中ITIH4 mRNA表達(dá)量下降。本研究結(jié)果亦顯示在血清多肽圖譜中該多肽峰表達(dá)下調(diào)，其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制及其作為診斷標(biāo)志物的價(jià)值還有待進(jìn)一步研究。

本研究選用NSCLC患者以及健康者的血清作為研究對(duì)象，應(yīng)用ClinProtTM系統(tǒng)的MALDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)血清多肽，對(duì)特異的NSCLC相關(guān)多肽小規(guī)模驗(yàn)證，得到了相對(duì)較高的敏感性和特異性。由于我們收集的標(biāo)本主要來源于IV期患者且多為腺癌患者，以后將納入更多的I期患者標(biāo)本甚至動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)高危人群的標(biāo)本，以及鱗癌等其它組織學(xué)類型的NSCLC標(biāo)本，進(jìn)一步驗(yàn)證該診斷模型的敏感性和特異性。用于NSCLC診斷的特異血清多肽譜模型，具有無創(chuàng)、標(biāo)本量需求少、簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢(shì)，下一步我們需要在臨床實(shí)際工作中進(jìn)行大規(guī)模驗(yàn)證，希望為建立NSCLC血清學(xué)診斷方法奠定基礎(chǔ)。