人肺癌A549細胞系腫瘤干細胞的篩選和鑒定

夏暉 于長海 張文 張寶石 趙英男 方芳

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌總數的80%-85%，對放療和化療易產生抵抗性，患者5年的生存率低，生存質量差[1,2]。深入研究肺癌發生，發展的分子機制，探尋新的治療靶點，提高NSCLC的臨床治療效果是人們關注的問題。腫瘤干細胞（cancer stem cells,CSCs）是處于各種不同分化程度的一小群干細胞樣細胞，具有自我更新和無限增殖能力以及多向分化潛能，是腫瘤形成的起始細胞并維持腫瘤的持續生長，在腫瘤的發生、進展、轉移、復發及耐藥中起關鍵作用。目前研究[3,4]認為，腫瘤干細胞對常規治療有抵抗性，且具有再次形成腫瘤的能力，因而其可能是腫瘤復發轉移的根源。研究[5,6]表明，CD133陽性細胞具有高度增殖分化潛能和體內成瘤能力及干細胞樣特性；ABC轉運蛋白家族中ABCG2（ATP-binding cassette superfamily G member 2, ABCG2）與干細胞泵出Hoechst染料的特性有關，經此方法分離得到的SP細胞經鑒定就可確認為干細胞，ABCG2已被認為是一種篩選干細胞的表面標志物分子；為了研究腫瘤干細胞的生物學特性，如何分離出腫瘤干細胞是關鍵的一步。肺癌干細胞被視為是肺癌惡性表型的根源和潛在的治療靶點。本研究選用NSCLC細胞系A549為研究對象，通過免疫熒光激活的流式細胞術篩選A549細胞系中SP（side population）細胞亞群，并觀察CD133和ABCG2的表達，為探索NSCLC治療的新途徑提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 人肺癌A549細胞株購于軍事醫學科學院。二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）、Hoechesl33342、維拉帕米（Verapamil）購于Sigma公司；胎牛血清購于Hyclone公司；DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）培養基購于Gibco公司。細胞培養箱為日本Tabai Espec Co.生產。

1.2 細胞培養 人肺癌A549細胞，常規培養于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養基中，置37oC、5%CO2孵箱內培養。取對數生長期細胞制備成 1×106/L單細胞懸液，加入Hoechst33342染料（5 μg/mL），37oC避光條件下，孵育90 min。對照組細胞中，同時加入維拉帕米（100 mM），按上述過程處理細胞。各組細胞經FACS緩沖液處理后，在355 nm激發光波長處，應用流式細胞儀檢測各組細胞設定參數的變化，測量前向散射和側向散射參數，以Hoechst red為X軸，Hoechst blue為Y軸作二維散點圖，將維拉帕米組缺失的區域設為SP細胞范圍，分選出SP干細胞亞群和非SP干細胞亞群，并計算百分比。將分選出的SP細胞和非SP細胞分別接種于10%的軟瓊脂，觀察兩組細胞克隆形成能力的差別。MTT法觀察所篩選的兩組細胞增殖能力的區別，并繪制細胞生長曲線。

1.3 RT-PCR分析 經流式細胞儀分選的SP細胞和非SP細胞，以1×106/瓶接種A549細胞于T25培養瓶，置5%CO2孵箱。取對數生長中期的細胞，Trizol法提取細胞總RNA，RT-PCR分析干細胞標志物分子CD133和ABCG2 mRNA表達的變化，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，0.5%溴化乙錠染色后，凝膠成像儀觀察圖像并計算灰度值，分析各組間差異。

1.4 Western blot分析 經流式細胞儀分選的SP細胞和非SP細胞，以1×106/瓶接種A549細胞于T25培養瓶，置5%CO2孵箱。取對數生長中期的細胞，加入細胞裂解液，15,000 rpm、10 min，取上清，Bradford法蛋白定量，經SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，再分別加入CD133和ABCG2分子的一抗（1:1,000）和辣根酶標記的二抗（1:500），室溫下振蕩孵育1 h，ECL發光試劑盒發光顯影，Bio-Rad圖像分析軟件進行圖像掃描和分析。同時用內參蛋白Actin對目的分子進行標準化。

1.5 致瘤能力實驗 經流式細胞儀分選的上述SP細胞和非SP細胞，以1×104的密度接種至裸鼠皮下，2周后觀察兩組細胞致瘤能力的差別。

1.6 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差別有統計學意義。

2 結果

2.1 A549細胞中SP干細胞亞群的分選 如圖1所示，肺癌細胞系A549細胞中SP細胞分布情況。圖1A顯示SP細胞所占比例為5.93%。圖1B為加入維拉帕米的對照組，SP細胞基本消失為0.32%。圖1C顯示SP細胞可以形成明顯的腫瘤細胞克隆。圖1D顯示非SP細胞不能形成明顯的細胞克隆。

2.2 細胞增殖結果 圖2所示，經流式細胞術篩選的SP細胞和非SP細胞在無血清培養條件下，分別繪制生長曲線，兩組細胞增殖能力差別明顯，SP細胞具有明顯的增殖效應（P＜0.001, n=6）。

2.3 RT-PCR結果 圖3結果顯示，SP干細胞亞群中CD133和ABCG2 mRNA明顯高于非SP干細胞亞群（P＜0.05, n=5）。

2.4 Western blot結果 圖4結果顯示，SP干細胞亞群中CD133和ABCG2 mRNA明顯高于非SP干細胞亞群（P＜0.05,n=5），各組A549細胞的內參蛋白Actin表達水平一致。

2.5 動物實驗結果 圖5結果顯示，接種SP亞群細胞的動物，2周后可以形成明顯的種植瘤，而對照組非SP亞群細胞種植的動物未見有明顯的腫瘤形成（P＜0.001, n=7）。

3 討論

CSCs也稱為“腫瘤起始細胞”（tumor initiating cells,TICs），具有自我更新和無限增殖能力以及多向分化潛能。研究[7,8]發現，在血液系統、神經系統腫瘤、乳腺癌等腫瘤中，干細胞樣細胞決定了腫瘤的發生和發展過程。腫瘤干細胞學說和理論不僅為腫瘤發生、發展和轉移機制的研究帶來新的思路，同時為腫瘤臨床診斷和治療帶來新希望，是腫瘤學領域具有劃時代意義的全新理論。本研究中，肺癌干細胞的篩選主要是利用干細胞中轉運蛋白可以主動外泵熒光染料（Hoechst染料）的特點，結合流式細胞術，經過雙波長分析，激發不同顏色的弱紅光和藍光，此群呈鳥嘴狀分布的細胞主要集中于低熒光信號區域，僅占總體肺癌細胞的極少數，即為肺癌的邊緣群細胞（SP細胞），而不具有外排功能的、高熒光信號的細胞即為占細胞整體絕大多數的非SP細胞。

圖 1 流式細胞術篩選SP干細胞亞群Fig 1 Isolated slide population (SP) cancer stem cells using FACS

圖 2 SP細胞和非SP細胞增殖能力比較Fig 2 The ability of cell proliferation between SP and non-SP cells

圖 3 CD133和ABCG2 mRNA表達水平。A、C：CD133 mRNA表達；B、D：ABCG2 mRNA表達。Fig 3 The expression level of CD133 and ABCG2 mRNA. A, C: CD133 mRNA expression; B, D: ABCG2 mRNA expression.

圖 4 CD133和ABCG2蛋白表達水平。A、C：CD133蛋白表達；B、D：ABCG2蛋白表達。Fig 4 The expression level of CD133 and ABCG2 protein. A, C: CD133 protein expression; B, D:ABCG2 protein expression.

圖 5 體外致瘤能力實驗Fig 5 The tumorigenicity experiment in vitro

我們的研究結果表明，經過流式細胞儀成功分選了人肺腺癌A549細胞系SP細胞亞群，結果表明此SP細胞亞群約占A549細胞總數的5.93%，經維拉帕米處理后Hoechest33342陰性/弱陽性細胞含量下降為0.32%，結合文獻報道，維拉帕米可以阻斷SP細胞排出Hoechest33342，提示此亞群細胞體現Hoechest33342陰性/弱陽性的特性，為篩選所分離的SP細胞，其克隆形成能力明顯高于非SP細胞。同時，MTT結果提示，經流式細胞術篩選的SP細胞和非SP細胞在無血清培養條件下，兩組細胞增殖能力差別明顯，SP細胞具有明顯的增殖效應。體外致瘤能力實驗發現，接種SP亞群細胞的動物，2周后可以形成明顯的種植瘤，而對照組非SP亞群細胞種植的動物未見有明顯的腫瘤形成。

據文獻報道，CD133為人造血干細胞和祖細胞的標志物分子，同時在多種腫瘤組織中還發現CD133分子的高表達可以作為肝癌、前列腺癌、胰腺癌、結腸癌等腫瘤干細胞的陽性標記物分子。研究[9,10]發現，CD133陽性細胞具有自我更新、不斷分化并促進腫瘤生長的特性，與患者的淋巴轉移和預后相關。我們的試驗結果也表明，經過流式細胞儀篩選的肺癌SP細胞群，明顯地高表達干細胞標志物分子CD133，提示經過篩選分離的肺癌SP細胞群具有干細胞樣特性。ABCG2分子屬于ABC轉運蛋白超家族，編碼由655個氨基酸組成的跨膜蛋白，在白血病細胞或乳腺癌等腫瘤干細胞表面均有表達。研究[11,12]發現，白血病細胞或乳腺癌細胞的耐藥性與ABCG2蛋白密切相關，下調ABCG2分子的表達可以降低腫瘤細胞耐藥現象的發生，提示ABCG2作為腫瘤干細胞表面的標志物分子，可能與腫瘤干細胞參與耐藥的過程相關。我們的試驗結果表明，經過流式細胞儀篩選的肺癌SP細胞群明顯地高表達干細胞標志物分子ABCG2。

我們的研究證明：流式細胞術篩選的SP細胞，經mRNA和蛋白水平分析，均高表達CD133和ABCG2；我們所篩選的SP細胞可以形成明顯的腫瘤細胞克隆，而非SP細胞不能形成明顯的細胞克隆，SP細胞細胞增殖能力和體外致瘤能力均明顯高于非SP細胞，上述結果明確提示我們所篩選的細胞為肺癌干細胞。綜上所述，本研究中經流式細胞術分離篩選的肺癌SP細胞群，表達特異性的干細胞標志物分子CD133和ABCG2，可以用于進一步的肺癌干細胞的研究中，為肺癌干細胞參與肺癌的發生，發展及耐藥等機制的深入研究提供了實驗依據和理論基礎，具有一定的實際應用價值和意義，但具體相關機制還有待進一步的實驗來證實。