NO對月季采后超氧化歧化酶的影響

邱 芬，趙 根

(1.浙江大學農業與生物技術學院，浙江杭州 310058;2.湖州市農業科學研究院，浙江湖州 313000)

月季 (Rosa hybrida)被譽為花中皇后［1－2］，采后生理及貯藏保鮮技術的研究對其鮮切花生產和采后生理理論研究具有重要意義。薛秋華等［3］研究了薩蔓莎切花衰老過程中超氧化歧化酶 (SOD)活性的變化，為延緩月季衰老提供依據。SOD是活性氧清除反應過程中第一個發揮作用的抗氧化酶，在抗氧化酶類中處于核心地位。研究表明，噴施低濃度SNP(sodium nitroprusside，硝普鈉)可有效提高南方紅豆杉幼苗SOD活性［4］。NaCl脅迫下添加外源NO提高了燕麥幼苗的株高和SOD活性［5］。王松華等［6］研究發現，外源 NO 對 Ni毒害有緩解作用。還有研究表明，100 μmol·L－1Ni處理能使小麥幼苗 SOD等抗氧化酶活性升高［7－8］。本試驗將以SNP為外源NO供體對月季采后SOD活性影響展開研究。SNP是目前常用的NO供體。通過試驗觀察SNP處理后鮮切花月季中的SOD活性的變化，從而分析外源NO對月季SOD活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為月季品種薩蔓莎。訂購60枝未經過任何處理的切花，直接干儲運回試驗室供用。選擇含苞待放，花枝大小形態基本一致的健壯花枝39枝作為試驗材料。

1.2 主要儀器及試劑

主要儀器。UV-2550紫外可見分光光度計，臺式高速冷凍離心機 (杭州達科，吉西今科學儀器有限公司)，FA1104型電子天平 (上海衡平儀器儀表廠)，移液槍等。

儲備液A。稱取15.6 g NaH2PO4·2H2O于燒杯中用蒸餾水溶解，移入500 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。

儲備液B。稱取35.85 g Na2HPO4·12 H2O于燒杯中用蒸餾水溶解，移入500 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。

分別取上述A液8.5 mL和B液91.5 mL，用300 mL蒸餾水充分混勻后即為0.05 mol·L－1磷酸緩沖液 (pH值7.8，含0.1 mmol·L－1EDTA)。

NBT(氯化硝基四氮唑藍)反應液。稱取0.012 04 g核黃素溶于100 mL蒸餾水中，取4 mL，稱取0.387 g甲硫氨酸，0.010 3 g NBT，加入磷酸鹽緩沖液 (pH值7.8)196 mL溶解。

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。

1.3 試驗方法

1.3.1 瓶插處理

以100 μmol·L－1SNP為NO的供體。試驗在室溫下進行，保持溫度、光照等因素相同，在系統誤差之內。觀察月季切花在單一因素 (SNP處理)下的SOD活性變化情況。以蒸餾水為對照組。

1.3.2 瓶插預處理

將運回試驗室的花材去除多余葉片，留取花梗30±2 cm，由基部45°剪后即插入蒸餾水中，使花梗基部浸入水中3 cm左右，恢復24 d(誤差0.5 h)，使其充分吸水。經過預處理，挑取健壯、開放程度基本一致的月季切花共39枝，挑出3枝作試驗樣品，待測，記為第0天，其余36支分為對照 (CK)和處理 (T)2組，重復3次。其中對照組以蒸餾水為瓶插液，處理組用100 μmol·L－1SNP為瓶插液，將其置于常溫、漫射光試驗臺上，每日觀察記錄。

對照組 (CK)。將其中18枝平均放入3個盛有等量蒸餾水的瓶中，每瓶6枝，編號分別為CK1，CK2和 CK3。

處理組。將另外18枝平均放入3個盛有等量100 μmol·L－1SNP的瓶中，每瓶6枝，編號分別為 T1，T2，T3。

1.3.3 測定時間段

根據開花級數通行標準，從蕾期至萎蔫劃分為6級:0級，花萼抱合直立;1級，花萼開展至水平;2級，花瓣開始松散;3級，花瓣初開，外層花瓣展開;4級，盛開，多層花瓣展開;5級，盛末，花瓣全開花朵露心;6級，蔫初，花瓣翻卷或萎蔫。在第0天 (2～3級)、切花達到盛花期(3～4級，第3天)、開始衰敗期 (5級，第9天)、失去觀賞價值期 (6級，第13天)各取樣1次。

1.3.4 測定指標

SOD活性。測定部位為花瓣、花萼、花梗。

在每個時間段測定時，從3個對照瓶中各取1枝，分別測定3個部位的上述指標，記錄數據。處理瓶測定方法同上。

1.4 月季SOD提取液的制備

取樣部位為花瓣、花萼、花梗，各部位樣品分別取0.6 g(精確到0.01 g)。為減小系統誤差，花瓣取樣采用先去除最外層花瓣，然后將剩余花瓣剪碎混勻稱取樣品;花萼同花瓣的取樣方法;花梗取的是距花托5～10 cm莖段，剪碎混勻取樣。其中邊取樣邊用液氮快速研磨，盡可能準確測定試驗指標。在每個時間段測定時，從3個對照瓶 (CK)和3個處理瓶 (T)中，每瓶取形態相近的花材1枝，統一剪取花瓣、花萼、花梗，用電子天平各準確稱0.6 g樣品 (精確到0.01 g)，共18份。每份提取粗酶液時，將樣品放進冰浴預冷的研缽中，加液氮快速研磨成粉末，然后加3次pH值7.8的磷酸鹽緩沖液，每次加2 mL，再加少量2%的PVP快速碾磨成勻漿，完成后將樣品轉入到10 mL的離心管中，用2 mL磷酸緩沖液洗滌研缽，將洗液一并轉入離心管中，成對調節平衡后用冷凍離心機在4℃，12 000 g·min－1下離心20 min，上清液即為SOD提取液，將其轉入小試管中保存于4℃冰箱中備用。

1.5 紫外分光光度法測定SOD活性

1.5.1 紫外分光光度法

利用NBT法測定。取小試管18支并編號，依次加入各酶液上清液50 μL和3 mL NBT反應液為樣品管。另取3支小試管，加入50 μL磷酸緩沖液和3 mL NBT溶液，2支用雙層黑紙套筒全程遮光做調零用，另1支作對照管，和樣品管一起在25℃下燈光照25 min(觀察顏色變化，不能太深)。測560 nm下吸光值 (D)。

1.5.2 數據處理

15 μL酶液+3 mL考馬斯亮藍，于595 nm下測月季可溶性蛋白D值。

牛血清蛋白標準曲線作為蛋白標準曲線:Y=0.290 8X+0.004 6(Y為吸光值，X為蛋白質含量)，利用NBT光照還原紫外分光光度法將試驗測得的月季D值代入Y，求得X。

月季可溶性蛋白質含量:

M(mg·g－1鮮重)=X·VT·FW－1·V－11。

式中，VT為樣液總體積 (mL)，V1為測定時樣品用量 (mL)，FW為鮮重 (g)。

SOD活性=(DCK－Df)VT(0.5DCK·0.6M·V1)－1。

式中，DCK為照光對照管的光吸收值，Df為樣品管的光吸收值，VT為樣液總體積 (mL)，V1為測定時樣品用量 (mL)，M為1 g樣品中可溶性蛋白的含量。

2 結果與分析

2.1 花瓣SOD活性的變化

表1顯示，瓶插前期，第0天 (復水后第1天)對照和處理花瓣SOD活性基本一致;第3天(切花達到盛花期)測定，SOD活性跟第0天相比，數值上升很多，說明瓶插前期，SOD活性值呈逐漸上升趨勢;第6天 (開始衰敗期)測定，SOD活性值有所下降，第9天 (失去觀賞價值期)測定，SOD活性值又下降一些。說明切花瓶插第3天，處于開花最佳時期時，SOD活性達到最大，第6天和第9天花開始衰敗和失去觀賞價值，SOD活性隨之下降;在整個瓶插過程中，花瓣SOD活性呈先升后降的趨勢。經SNP處理的月季切花花瓣的SOD活性值明顯大于對照組。

2.2 花萼SOD活性的變化

表2顯示，瓶插前期，第0天 (復水后第1天)對照和處理花托SOD活性基本一致;第3天(切花達到盛花期)測定，與第1天相比，SOD活性上升很多，說明瓶插前期，SOD活性值呈逐漸上升趨勢;第6天 (開始衰敗期)測定，SOD活性值有所下降;第9天 (失去觀賞價值期)測定，SOD活性值又下降一些。說明切花瓶插第3天，處于開花最佳時期時，SOD活性達到最大，第6天和第9天花開始衰敗和失去觀賞價值，SOD活性隨之下降。在整個瓶插過程中，花瓣SOD活性呈先升后降的趨勢。而經過SNP處理的月季切花花萼的SOD活性值明顯大于對照組。

表1 不同時間NO對月季花瓣SOD活性的影響

表2 不同時間NO對月季花萼SOD活性的影響

2.3 花梗SOD活性的變化

表3顯示，瓶插前期，第0天 (復水后第1天)對照和處理花彎莖SOD活性基本一致;第3天 (切花達到盛花期)測定，與第1天相比，SOD活性值上升很多，說明瓶插前期，SOD活性值呈逐漸上升趨勢;第6天 (開始衰敗期)測定，SOD活性值有所下降;第9天 (失去觀賞價值期)測定，SOD活性值又下降一些。說明切花瓶插第3天，處于開花最佳時期時，SOD活性達到最大，第6天和第9天花開始衰敗和失去觀賞價值，SOD活性隨之下降。在整個瓶插過程中，花瓣SOD活性呈先升后降的趨勢。經SNP處理的月季切花花彎莖的SOD活性值明顯大于對照組。

表3 不同時間NO對月季花梗SOD活性的影響

綜上可知，月季切花在瓶插過程中，不同部位的SOD活性值均呈先迅速上升，達到最大值后逐漸下降的趨勢。月季切花瓶插前期，SOD活性迅速增強，表明切花吸水量增加，清除活性氧保護酶的活性提高，提高了清除活性氧的能力。瓶插后期隨著切花的蒸騰作用超過其吸水速率，花瓣中SOD和CAT活性下降，活性氧的產生與清除平衡系統受到破壞，導致膜脂過氧化加劇，MDA大量積累，質膜損傷，透性增加，造成花朵衰老，最終死亡。

試驗顯示，處理組SOD活性值高于對照組，說明NO有增強SOD活性的功能。張少穎等［9］首次將NO保鮮的研究用于月季切花，并獲得了預期的效果。此外，100 μmol·L－1SNP能降低月季切花各部位的萎蔫率，說明外源NO能夠延緩月季切花的衰老，延長瓶插壽命。

3 小結和討論

試驗通過用 100 μmol·L－1的外源 NO 供體SNP作為瓶插液對月季切花進行處理培養，結果表明，不同測定時間的SOD活性均明顯高于對照組(蒸餾水處理)。可能NO通過某種途徑誘導了SOD抗氧化酶基因的表達，增強了其活性。有研究顯示，NO能誘導CAT和APX活性，并對CAT，SOD轉錄水平有影響［10］。100 μmol·L－1SNP 對鹽脅迫下白骨壤 (A.marina)葉片SOD活性的影響是通過非 cGMP 依賴途徑實現的［11］。Beligni等［10］發現，GA可減少大麥糊粉層中CSOD的含量，而NO可延緩GA所引起的CAT和SOD的減少。目前，適當濃度的外源NO能提高植物抗逆性的論斷已基本上得到認同［12］。試驗證明，100 mol·L－1硝普鈉 (SNP)+干旱處理顯著提高了刺槐幼苗葉片的SOD 和 POD 活性［13］。劉建新等［14］研究也表明，100 μmol·L－1SNP顯著提高了幼苗葉片SOD含量。試驗研究確定了外源NO對月季采后SOD活性的影響，得出NO能增強SOD活性，延緩月季切花衰老，延長采后壽命的結論，對月季切花保鮮技術研究具有重要意義。但在外源NO保鮮技術如何運用到實際切花保鮮方面還有待進一步探索研究，期待月季切花采后保鮮乃至其他切花保鮮道路上的重大突破。

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