蘆竹內源性寡糖素抑制藍藻活性的作用

郭靜雯，張忠山，王曉梅，韓志萍，張易祥

(1.湖州師范學院生命科學學院，浙江湖州 313000;2.福建省化學生物學重點實驗室，福建廈門 361000)

近年來，人們為了治理富營養化水域，利用高等水生植物與藻類的相互作用現象達到目的。目前已有較多植物的抑藻成分得到提取和鑒定，并在水域生態保護上起到重要作用［1－3］。本文報道了蘆竹提取物對藍藻 (藍藻)的抑制作用，并從中提取分離出抑藻活性物質。

1 材料與方法

1.1 材料

蘆竹采于浙江省湖州師范學院德清湖岸，清洗干凈，烘干備用。銅綠微囊藻由生命科學學院細胞研究所獲得，實驗室擴大培養后用于試驗。

試劑乙醇、苯酚、葡萄糖等，除特殊說明外，均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆竹組織提取液的制備

稱取100 g干蘆竹植株 (粉碎至0.3 mm)，置于三口燒瓶中，加入10倍蒸餾水于80℃提取3 h，提取液濃縮至100～200 mL，加入4倍體積無水乙醇。過濾，將上清液濃縮凍干，同時收集沉淀。分別記錄醇溶物和水溶物，并各溶于水配制成10%濃度備用。

1.2.2 總糖含量的測定

準確稱取標準葡萄糖50 mg于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。分別吸取0.05，0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 mL各補蒸餾水至2.0 mL，然后加入1 mL 5%苯酚后快速加入濃硫酸5.0 mL。迅速搖勻，室溫靜置30 min后，于490 nm處測吸光度D。以2.0 mL蒸餾水作為空白組按照上述同樣操作步驟進行。以標準葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標來繪制標準葡萄糖曲線。

分別取樣品溶液適量補蒸餾水至2.0 mL，按照標準曲線步驟測定各濃度下的吸光度，并計算樣品中的總糖含量。

1.2.3 樣品分子量的測定

樣品分子量測定采用高效液相色譜法進行，色譜柱為TSK G3000(300 mm×7.8 mm)，柱溫為40℃。將樣品配成2%的硫酸鈉溶液上樣分析，2.84%的硫酸鈉溶液洗脫，流速為0.5 mL·min－1，示差檢測器檢測。標準多糖采用一系列的不同分子量的右旋多糖酐，其分子量為2 500～2 000 000 u。

1.2.4 樣品抑藻活性試驗

將樣品分別配成濃度為0.01%，0.05%，0.50%和5.00%的水溶液，加入到裝有BG-11培養基 (預先高溫高壓滅菌)的培養瓶中，每瓶接種入3 mL處于對數生長期的銅綠微囊藻細胞懸液。以蒸餾水為對照，每處理設2個重復。接種后置專用培養架上培養，培養溫度為25℃，光照強度為2 000 lx，光暗周期比為12 h∶12 h。

1.2.5 藍藻生長量的測定

分別于接種后第0～19天，在665和649 nm兩個波長下測定藍藻吸光度 (D665和D649)，以D665的變化表示藍藻細胞的生長情況。

1.2.6 葉綠素a的測定

葉綠素a的含量用比色法測定。色素的濃度=13.95D665－6.88D649。

1.2.7 數據處理

采用WPS軟件進行數據處理和作圖，應用SPSS 19.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 樣品提取液

將蘆竹葉提取液加入乙醇后，出現大量白色沉淀。上清液回收乙醇后冷凍干燥呈黃色，在空氣中暴露后迅速吸水呈現油狀，加水迅速溶解。兩者分別記錄為醇溶物和水溶物，但是均在水中可溶。

2.2 樣品總糖含量

采用苯酚－硫酸法測得葡萄糖標準曲線，當濃度0.002～0.010 mg·mL－1時線性關系最好。線性回歸方程為y=49.624x－0.004 6(R2=0.999 9)。在試驗條件下探索得取350 μL樣品溶液補蒸餾水至2.0 mL，分別測出的蘆竹葉上清液提取物和沉淀提取物的吸光度為最適吸光度。由標準曲線計算出蘆竹葉醇溶物和水溶物中總糖含量分別為0.14%和54.30%。

2.3 樣品分子量

經過高效凝膠色譜測定，醇溶物和水溶物的重均分子量分別為547和3 359 u。結合總糖含量測定結果，可得出水溶物應為寡糖素類化合物。

2.4 蘆竹葉上清液提取物對藍藻生長的影響

圖1表明，0.01%和0.05%的蘆竹葉上清液提取物對藍藻有一定的促進作用，且促進作用呈顯著增大的趨勢。5.00%的蘆竹葉上清液提取物則起穩定的抑制作用。而0.50%的蘆竹葉上清液提取物對藍藻生長的影響是復雜的。接種第0～15天有明顯的促進作用，從第16天開始又顯示抑制作用，且抑制的程度大小也有波動。

2.5 蘆竹葉沉淀提取物對藍藻生長的影響

觀察圖2可知，0.01%和0.05%的蘆竹葉沉淀提取物對藍藻生長有一定的促進作用，且兩者的促進程度相類似。在接種的第6～11天，0.50%的蘆竹葉沉淀提取物有小范圍的波動，但大體上呈抑制作用。5.00%的蘆竹葉沉淀提取物則從第4天開始呈平穩的抑制作用。

圖1 不同濃度上清液提取物吸光度隨時間的變化

圖2 不同濃度沉淀提取物的吸光度隨時間的變化

由圖3看出，葉綠素含量隨天數有明顯的變化，即反映的是接種藍藻的生長情況。與圖1對比，曲線呈類似的變化趨勢，可推斷藍藻出現不同的生長情況是因為在培養基內加了蘆竹葉上清液提取物的緣故。而不同濃度上清液提取物對藍藻生長的影響是不同的，基本符合高濃度抑制和低濃度促進的規律。對比圖2，4曲線，也能得到上述結論。

圖3 上清液提取物的葉綠素含量隨時間的變化

圖4 沉淀提取物的葉綠素含量隨時間的變化

3 小結和討論

近年來國內外學者大多數利用植物種植水［2，4］和植物提取物［5－7］進行藻類的化感作用研究。本研究表明，蘆竹植物器官組織不同物質具有不同的抑藻效果。試驗表明，蘆竹的水提取物中含有糖類物質，初步推測為纖維寡糖，具有一定抑藻活性，其結構有待于深入研究。蘆竹在江浙地區的水體岸邊具有較廣泛的分布，在富營養化水體中種植挺水植物蘆竹，不僅可吸收利用富營養化水體中的氮和磷，以及蘆竹釋放的抑藻化感物質，還可直接抑制藍藻的生長。因此，本研究可為探索切實可行的富營養化水體的生態治理提供科學依據。

［1］陳建中，李利芳，張海洋，等．蘆竹和睡蓮對銅綠微囊藻的生長抑制效應 ［J］．環境科學與技術，2011，34(7):35－37.

［2］李磊，侯文華．荷花和睡蓮種植水對銅綠微囊藻生長的抑制作用研究［J］．環境科學，2007，28(10):2180－2186.

［3］戴樹桂，趙凡，金朝暉，等．香蒲植物提取物的抑藻作用及其分離鑒定［J］．環境化學，1997，16(3):268－271.

［4］陳衛民，張清敏，戴樹桂．苦草與銅綠微囊藻的相互化感作用 ［J］．中國環境科學，2009，29(2):147－151.

［5］丁惠君，彭祺，張維昊，等．三種濕生植物對微囊藻的化感作用初步分析 ［J］．環境科學與技術，2007，30(4):6－10.

［6］馮菁，朱擎，吳為中，等．稻草浸泡液對藻類抑制作用機制 ［J］．環境科學，2008，29(12):3376－3381.

［7］洪喻，胡洪營，黃晶晶，等．不同溶劑提取蘆竹化感物質對銅綠微囊藻生長的影響 ［J］．環境科學，2008，29(11):3143－3147.