cDNA-AFLP技術在番茄及其黃化曲葉病毒互作中的應用

袁 偉，萬紅建，劉云飛，俞 錁，楊悅儉

(1．浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021;2．南京農業大學 園藝學院，江蘇 南京 210095)

基因表達是遺傳信息表現為生物性狀的過程，是按時間和空間順序進行的，這種表達的方式稱為基因的差異表達［1］。研究基因差異表達的方法很多，如抑制消減雜交，電子克隆技術，基因芯片和cDNA-AFLP技術等［2］。其中 cDNA-AFLP技術由于其重復性高，假陽性低，操作方便快捷，可反映基因間表達量的差異等優勢被廣泛應用在植物生物脅迫和非生物脅迫等多個領域。目前許多研究者將該技術用于基因的差異表達分析，尤其在抗病相關基因方面取得了較好的研究成果［3－5］。

番茄 (Solanum lycopersicumMill．)屬于茄科番茄屬，是世界性的蔬菜作物之一。近年來，隨著番茄栽培面積的增加，番茄黃化曲葉病毒病(TYLCD)已經成為番茄生產中最嚴重的病害之一。據初步統計，至少有40個國家的番茄正遭受此類病害的毀滅［6］。該病害首先在中國南方大面積爆發，自南向北發展，給我國的番茄產業帶來了毀滅性的災害［7－11］。該病害由番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)引起，一旦發病，會造成番茄大幅度減產甚至絕收［12］。

目前，越來越多抗TYLCV的野生番茄被篩選出來，通過野生番茄與栽培番茄雜交可以將抗病基因轉入到栽培番茄，從而緩解病害的發展。隨著分子標記技術的快速發展，研究者已經鑒定了5種不同抗 TYLCV的基因，分別為Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-4和Ty-5［13－17］，其中Ty-2抗病基因被廣泛應用于育種實踐之中。為了揭示番茄抗TYLCV的機理，本文初步分析cDNA-AFLP技術在番茄 (含有Ty-2抗病基因)與TYLCV互作過程中的應用，篩選差異表達片段，為今后克隆與Ty-2基因相關基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Banerjee等［18］從多毛番茄 B1063中選育得到抗TYLCV的材料-H24(含有Ty-2抗病基因)，本文使用經H24轉育后獲得的抗病材料07-027進行實驗研究，番茄植株生長于人工控制的氣候室內(白天25℃，夜間18℃)。

1.2 TYLCV的接種

當番茄材料長到4片真葉時，進行TYLCV的接種，將帶有TYLCV的農桿菌搖至D值為0.6～1.0，接種部位為番茄莖段的韌皮部，接種量保持一致，每株300 μL菌液。

1.3 總RNA的提取及雙鏈cDNA的合成

分別于接種后0，7，14，21，28，35 d取樣，采用混合取樣法摘取番茄幼嫩葉片，用錫箔紙包好于液氮中保存并放于－80℃超低溫冰箱冷凍保存。

RNA的提取及cDNA的獲得。RNA的提取采用Trizol法，cDNA的合成采用TaKaRa公司cDNA Synthesis kit合成雙鏈cDNA試劑盒，隨后調整6個樣品的cDNA濃度，使其一致。

1.4 cDNA-AFLP技術

cDNA-AFLP體系及程序參照 Vos等［19］的方法。分別用EcoRI，MseI酶切雙鏈 cDNA，37℃下4～6 h后與相應接頭連接，16℃過夜;連接后產物用預擴增引物擴增，將稀釋20倍的預擴增產物作為模板進行選擇性擴增，以篩選抗黃化曲葉病毒病相關基因差異表達片段。接頭、預擴增及選擇性擴增的引物見表1，其中選擇性擴增引物互相配對共64對。使用Bio-labs公司的SEQENCE-GT型電泳儀和測序電泳裝置，采用6%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳 (PAGE)分析。

為減少假陽性對試驗結果的干擾，本試驗對每個引物組合均作2次PCR擴增，只統計在2次擴增中都能穩定出現的條帶。

表1 接頭，預擴增及選擇性擴增引物

2 結果與分析

2.1 RNA和cDNA質量檢測

本試驗使用 Trizol法提取的幼葉總RNA具有較高的純度和濃度。1.2%瓊脂糖電泳檢測時可以看到亮而清晰的28S，18S和5S三條帶 (圖1)，且28S帶亮度略強于18S帶。經紫外分光光度計檢測，D260/D280值為 1.8～2.0，D260/D230值 ＞2.0，表明RNA純度較好，基本無降解，蛋白質和酚類的污染少，效果比較理想，可以用于下一步實驗。

圖1 RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

RNA經純化后，使用cDNA合成試劑盒合成雙鏈cDNA，通過擴增其內參基因來進行檢測。本文選用的內參基因為GAPDH(gi:380036164)，上游引物 F:GGCTGCAATCAAGGAGGAA，下游引物R:AAATCAATCACACGGGAACTG，目的片段大小為220 bp左右，通過PCR擴增后，用1.2%的瓊脂糖電泳進行檢測 (圖2)，檢測結果表明，條帶單一且清晰，雙鏈cDNA具有較好的質量及較高的濃度。

圖2 cDNA的GAPDH擴增結果

2.2 酶切、連接和預擴產物的檢測

選擇有6個堿基識別位點限制性內切酶EcoRI和MseI，對合成的雙鏈cDNA進行酶切，經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 (圖3)，均看到 100～2 000 bp的彌散條帶，表明酶切充分，其中100～750 bp條帶很亮，表明片段大多分布在這一區域內。

圖3 酶切產物的瓊脂糖電泳檢測結果

酶切產物經連接之后，使用預擴增產物進行與擴增，對于預擴增的產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 (圖 4)。結果表明，條帶100～1 500 bp，條帶彌散穩定，產物清晰，可用于下一步的選擇性擴增。

2.3 cDNA-AFLP的差異表達分析

圖4 預擴增產物的瓊脂糖電泳檢測結果

基因的表達差異在cDNA-AFLP的轉錄譜上主要表現為2個方面:量的差異 (條帶的深或淺)和質的差異 (條帶有或無)。本研究共選用64對引物進行選擇性擴增，分析抗TYLCV的番茄材料在不同時段中基因的差異表達。結果表明，共擴增出2 149條轉錄片段，其中差異條帶287條，上調156條，下調131條。圖5為部分cDNA-AFLP的轉錄圖譜，引物對分別為E-ACG/M-CTG， E-ACG/M-CCT， E-AGG/M-CAT，E-ACG/M-ACT。

從量的差異方面來看，圖5中A，B對應的圖表示有量的變化，箭頭所指的部分表明該轉錄片段隨著時間的變化，表達量亦發生了改變，A中箭頭所指的轉錄片段在接種后的14，21，28 d表達量升高，整體呈現先升高后下降的趨勢;從質的差異方面來看，圖5中 C，D對應的圖表示有質的變化，箭頭所指的部分表明該轉錄片段隨著時間的變化，間歇性地表達，C中箭頭所指的轉錄片段在接種后的7，21，35 d沒有表達。

圖5 部分選擇性擴增引物在6個不同時段的擴增譜帶

3 小結和討論

試驗中 RNA的提取采用Trizol法。在提取過程中，首先要防止RNA的降解，因為在周圍的空氣及一切實驗器材上都避免不了RNA酶的存在;其次要減少DNA、蛋白質及酚類物質的污染，提高RNA的純度。從結果看，試驗中提取的RNA質量及純度均較高，適合用于下一步的研究。檢測合成的雙鏈 cDNA，采用番茄最常用的內參基因GAPDH。從電泳圖中可以看出條帶大小，亮度均十分一致，表明雙鏈cDNA的濃度一致，減少了檢測樣本之間的差異。酶切和預擴增產物的檢測可以清晰的看到彌散均勻的條帶，表明雙酶切可以使酶切更充分，而預擴增可以使與預擴增引物配對的片段都預先擴增出來，防止其它過多的條帶影響選擇性擴增的結果，并為下一步的選擇性擴增提供了高質量的模板。

通過選擇性擴增共獲得287個轉錄差異片段，表明存在很多的與抗TYLCV相關的候選基因可能與抗病防御機制的功能蛋白相關。轉錄片段的差異表現從兩個不同的方面體現:首先是表達量的差異。某些基因的轉錄水平在各時間段表現出表達量的增強或減少。其次是質的差異。基因的表達在某一時間段甚至不表達，而在另一時間段又恢復表達。由于cDNA-AFLP技術顯示的是在植物轉錄水平上的差異，因此從分析結果看，表明基因的表達受到時間和空間的多重影響，番茄與TYLCV之間的互作機制和抗病反應也是植物體一系列功能基因轉錄水平上發生變化的綜合反應。

本研究表明，cDNA-AFLP技術對于揭示番茄與TYLCV互作機理是一種有效的方法，同時獲得的差異片段也可用于番茄抗TYLCV相關基因的克隆，為未來鑒定這些基因的功能奠定基礎。

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