黑芝麻黑色素萃取條件的響應面優化

楊善巖，李海龍，王升貴，狄志鴻，張 紅，黃 哲，張 杰

(1.浙江亞林生物科技股份有限公司，浙江 富陽 311400;2.嘉吉亞太食品系統有限公司 上海分公司，上海 徐匯 200031;3.諾維信中國投資有限公司，上海 浦東 200129;4.天津生物工程職業技術學院，天津 300462)

天然黑色素 (melanin)是廣泛存在于動植物體中的保護性色素，對生物機體有重要的保護作用。Nicollaus［1］根據黑色素降解產物不同將其分為吲哚型黑色素 (動物黑色素)和兒茶酚型黑色素(植物黑色素)。兒茶酚與單寧酸、鞣花酸等一起被稱為植物體內的紫外線過濾器，具有很好的美容防曬效果［2］。黑色素屬于生物大分子多聚物，分子量1 800～2 000 u，其結構單位為酚醌結構，不溶于酸性溶液，微溶于水，不溶于常見的有機溶劑，僅溶于少數幾種有毒的有機溶劑，如甲醇、二甲基亞砜等，但能溶于堿性水溶液。黑色素在紫外波長下有吸收峰，其吸收值與波長成反比［3］。黑芝麻黑色素安全無毒，具有較高的營養價值和藥理作用，廣泛應用于食品工業，如飲料、糕點、糖果、巧克力、果醬等［4］，有著十分廣闊的市場前景。

作者對文獻報道的各種黑芝麻黑色素萃取工藝［5－7］進行了分析論證，結合黑色素的理化性質進行反復試驗，發現采用堿提酸沉淀法簡單可靠，可得到較純的黑色素，并對萃取條件進行了響應面優化。

1 材料與方法

1.1 材料

市售黑芝麻，定量濾紙，NaOH、HCl均為分析純。

1.2 萃取工藝

利用NaOH溶液在一定溫度下水浴萃取，過濾后用HCl溶液中和濾液pH值至6.0，使黑色素絮凝。3 000 r·min－1離心10 min棄上清液，用水洗滌2～3次，于60℃烘干至恒重，即為黑色素粗品，得率計算公式如下:

式中:為得率 (%);m為黑色素質量 (g);W為黑芝麻質量 (g)。

1.3 色階的計算

精確稱取0.1 g自制黑色素，用pH值為8的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液溶解，定容至100 mL作為試樣。吸取10 mL移入100 mL容量瓶，用緩沖液定容至100 mL為待測樣，測其A270，色階計算公式如下［8］:

E=A×n/W。

式中:E為色階;A為吸光值;n為待測樣品稀釋倍數;W為樣品質量 (g)。

2 結果與討論

2.1 萃取劑濃度對萃取效果的影響

分別稱取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶中，各加入30，35，40，45，50，55，60 g·L－1的 NaOH溶液50 mL，60℃水浴浸提60 min，制備黑色素。如圖1所示，前期黑色素得率及色階都與萃取劑濃度成正比，均在50 g·L－1時達到峰值，此后又下降。究其原因，NaOH濃度增加黑色素溶解度增大，然而隨濃度的增加一些雜質的溶解率也在增加，與黑色素呈現競爭浸出，影響黑色素得率及純度。

圖1 萃取劑濃度對萃取效果的影響

黑色素存在于黑芝麻種皮中，種皮主要成分為黑色素和木質素，木質素易溶于NaOH溶液，更加速黑色素的溶解。NaOH溶液濃度不僅影響黑色素萃取效果，而且對成本及純化也有較大影響，所以萃取劑濃度至關重要。

2.2 萃取混合物濃度對萃取效果的影響

分別稱取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶，加入NaOH溶液，使萃取混合物濃度分別為200，220，240，260，280，300 g·L－1，60℃ 水浴浸提 60 min，制備黑色素。如圖2所示，黑色素得率與萃取混合物濃度成反比，低于240 g·L－1得率及色階較高且穩定;高于240 g·L－1黑色素得率及色階急劇下降。

圖2 萃取混合物濃度對萃取效果的影響

固液洗脫中，溶液比例越大越利于洗脫。因為溶液量越大，固相與液相之間的目標物質濃度差就越大，目標物質就越易溶解到液相。在黑芝麻萃取中，萃取液比例越大黑色素就越易溶出。

2.3 溫度對萃取效果的影響

分別稱取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶中，各加40 mL 50 g·L－1的NaOH溶液。分別于50，55，60，65，70，75，80，85，90℃水浴浸提 60 min，制備黑色素。如圖3所示，黑色素得率與溫度成正比，65℃后增加趨勢變緩;色階則呈現先高后低的趨勢，65℃出現峰值。

圖3 萃取溫度對萃取效果的影響

水分子是不斷運動的，溫度越高水分子運動速率越快，溶質在溶液中的擴散速度就越快，所以黑色素溶解速率越快，但此時雜質也更易溶出而且黑色素的分解也在加速，使黑色素純度降低。

2.4 時間對萃取效果的影響

分別稱取10 g黑芝麻于250 mL三角瓶中，各加入50 g·L－1的NaOH溶液40 mL，分別于60℃水浴浸提 20，40，60，80，100，120，140 min，制備黑色素。如圖4所示，黑色素得率隨時間增長而提高，80 min后基本不再增加。色階開始時與時間成正比，80～120 min最大，此后略有下降。

圖4 時間對萃取效果的影響

黑色素溶出是一個漸進過程，時間越長得率越高，但時間越長雜質溶出也越多，影響純度，所以萃取時間不宜過長。

2.5 萃取條件的響應面優化

用 Design-Expert8.0.6的 Box-Behnken試驗，對黑色素萃取條件進行四因素三水平試驗。因素、編碼、－1，0，1水平:萃取劑濃度 (X1)分別為45，50，55 g·L－1;萃取混合物濃度 (X2)分別為260，240，220 g·L－1;萃取溫度 (X3)分別為60，65，70℃;萃取時間 (X4)分別為 60，80，100 min。

試驗結果見表1。

表1 Box-Behnken試驗各處理組合的得率和色階

利用Design-Expert8.0.6軟件對結果進行分析，擬合得到黑色素得率及色階的多元回歸模型:

對回歸模型進行方差分析，萃取劑濃度、萃取混合物濃度、溫度和時間對得率及色階有顯著正效應，失擬項P值分別為0.139 6和0.055 0，均 ＞0.05，P為不顯著，說明回歸模型顯著。決定系數R2分別為0.907 4和0.999 3，均 ＞0.9，說明回歸模型擬合良好。

D為進一步研究相關變量之間的交互作用及確定最優點［9－10］，利用 Design-Expert軟件分析二次回歸模型，繪制響應面分析立體圖和等高線圖。圖5－6為部分響應面分析立體圖和等高線圖，等高線圖可以直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，各圖中等高線均呈橢圓形，表明兩因素交互作用顯著，由立體圖可見擬合面具有真實的最大值。經軟件分析得到最佳萃取劑濃度、萃取混合物濃度、萃取溫度及萃取時間分別為 50 g·L－1，240 g·L－1，65℃和80 min。得率和色階的最高預測值分別為0.457 7%和245.223。

圖5 萃取混合物濃度和溫度對得率影響的響應面及等高線

2.6 驗證試驗

為驗證模型預測的準確性，用優化后的條件進行試驗，黑色素得率為0.439%，E=243.197，基本吻合模型預測最大響應值，說明模型合理有效。

圖6 萃取劑濃度和萃取混合物濃度對色階影響的響應面及等高線

3 小結與討論

黑芝麻黑色素是一種營養及食用價值均很高的天然功能性色素，我國對黑芝麻黑色素的研究開發較少。本研究采用響應面法，對黑芝麻黑色素的堿提酸沉淀萃取工藝進行優化，得到最佳萃取劑濃度、萃取混合物濃度、萃取溫度及萃取時間分別為50 g·L－1，240 g·L－1，65 ℃ 和 80 min。經驗證得率和色階分別為0.439%和243.197。

該工藝制備的黑色素粗品，得率較高，E＞240，純度略低于樣品 (E=310)，所以后期還需要一定的純化工作。需要注意的是，在黑色素分子中存在氨基，中和濾液堿性時HCl溶液濃度不能太高，否則會因 HCl局部濃度過高，與氨基反應放出NH3。另外，萃取次數對黑色素得率也有一定的影響，在實際生產中可多次萃取，以提高黑色素得率。該工藝簡單、成本低廉，而且可變廢為寶提高黑芝麻的附加值。

［1］Nicolans R A． Melanins［G］//Chemistry of Natural Products．Pairs:Harmann，1968:68 －91．

［2］周文杰，鮑時安．蘋果多酚防曬霜的研制 ［J］．廣東化工，2008，35(2):46－48．

［3］單良，徐麗萍，金青哲，等．黑芝麻黑色素的穩定性及自由基清除活性 ［J］．安徽農業科學，2008，36(26):11527－11531．

［4］張奇志，賴來展，廖均元．黑色食品的營養與功能研究進展 ［J］．糧油食品科技，2006，14(6):11－13．

［5］徐麗萍，王興國，金青哲，等．黑芝麻中黑色素萃取條件的研究 ［J］．中國油脂，2006，31(4):56－59．

［6］孫玲，張名位．黑芝麻色素的萃取條件和穩定性研究［J］．中國糧油學報，1998(4):53－58．

［7］武文潔，姚培正，王萬森，等．黑芝麻色素萃取與性質研究 ［J］．廣州食品工業科技，2002，18(1):32－33．

［8］李昌，聶少平，謝建華．黑芝麻黑色素的研究進展 ［J］．食品工業科技，2010，31(6):41－416．

［9］Li Chuan，Bai J H，Cai Z L．Optimization of a cultural medium for bacteriocin production byLactococcus lactisusing response surface methodology ［J］．Journal of Biotechnology，2002，93:27－34．

［10］華承偉，于江傲，謝鳳珍．紅色鏈霉菌發酵產紅霉素培養基的響應面優化 ［J］．生物制品學雜志，2011，24(6):728－736．