納米二次離子質譜技術(NanoSIMS)在微生物生態學研究中的應用

胡行偉，張麗梅，賀紀正，*

(1．中國科學院生態環境研究中心，城市與區域生態國家重點實驗室，北京 100085;2．中國科學院研究生院，北京 100049)

氮(N)、碳(C)、硫(S)等生命元素的生物地球化學循環過程主要由微生物所驅動。耦合分析自然環境中微生物遺傳多樣性與其代謝多樣性是當今微生物生態學研究的難點和熱點。自然環境中的微生物多樣性極為豐富，每噸土壤中的微生物類群可高達400萬種，海洋中的微生物類群也超過200萬種［1］。實驗室富集分離的傳統純培養方法對微生物生理生態功能的認識做出了巨大貢獻，但截止到2003年7月，全球范圍內僅分離培養出4800種細菌［2］，這極大地限制了人們對微生物功能多樣性的認識。過去幾十年里，人們通過從環境樣品中提取微生物DNA直接進行聚合酶鏈式反應(PCR)，并利用PCR產物構建克隆文庫并進行測序分析，發現了大量的未知序列。通過將這些未知序列與已知的分離培養微生物序列進行比對，從而推測這些未培養微生物的可能代謝類型，成為人們認識微生物多樣性和功能的重要手段。但是，具有相似16S rRNA基因組成的類群不一定具有相同的代謝功能［3-4］，豐度較高的微生物并不一定發揮更重要的生態功能［5］，而且PCR反應可能帶來一定的偏差，這成為基于PCR的分子生物學研究手段的主要缺陷。考慮到微生物的廣泛分布及其在元素地球化學循環中的重要作用，需要更先進的技術對自然環境樣品中的微生物群落和功能進行探測。

近年逐步興起的納米二次離子質譜技術(NanoSIMS)在國際上已被廣泛應用于地球科學、材料科學、比較行星學、生物醫學和礦物學等領域，并在微生物生態學研究中顯示出巨大的潛力，是當前最為先進的表面和界面分析技術，具有廣闊的應用前景。通過利用穩定性或放射性同位素在原位或者微宇宙條件下標記目標微生物，并與特異性的熒光原位雜交技術(FISH)、催化報告沉積熒光原位雜交技術(CARD-FISH)、鹵素原位雜交技術(HISH)等聯合應用，NanoSIMS為從單細胞成像水平上研究復雜環境樣品中微生物群落的組成和代謝特征提供了前所未有的可能性，其極高的靈敏度和準確性比其它的單細胞研究手段更具優勢。本文將對納米二次離子質譜的工作原理及其在微生物生態學研究領域的相關應用、存在的問題和發展趨勢等進行簡要介紹。

1 納米二次離子質譜技術(NanoSIMS)的原理

二次離子質譜技術(SIMS)是20世紀70年代發展起來的一種表面分析技術，它以一種離子(如Cs+或O-初級離子束)轟擊固體表面，再將從表面濺射出來的次級離子引入磁場質量分析器，不同離子根據質荷比不同在靜電場區被分離開，經質譜檢測器檢測記錄并成像，得出被分析樣品表面的元素或化合物的組分。SIMS可以檢測從氫到鈾的所有元素、同位素和化合物，并以檢測原離子轟擊樣品表面產生的特征(“指紋”)次級離子譜為基礎的，因此既可提供樣品表面元素的信息，也可提供化學組分的信息，具有較高的空間分辨率和質量分辨率。SIMS技術經歷了幾次更新，被廣泛應用于材料學、生物醫學、地質學和土壤學等領域。SIMS一般分為靜態SIMS和動態SIMS兩種［6］。靜態SIMS，例如飛行時間二次離子質譜(ToF-SIMS)，根據測定激發的二次離子飛行到接收器所用的時間來判斷離子種類，一般對樣品表面的一個到兩個原子層(＜1 nm)進行分析，只能提供關于樣品淺層表面的信息，在應用于生態學研究時很難找到合適的條件同時滿足較高質量分辨率和空間分辨率(一般只能達到微米級)的要求［7］;而動態SIMS如CAMECA IMS 1270-180型、CAMECA IMS-3f-7f型、及最先進的CAMECA NanoSIMS 50L型，主要根據二次離子在磁場中的偏轉半徑不同來確定離子種類，可以獲得樣品表面幾微米內元素同位素分布和組成的信息(空間分辨率達到亞微米級或者納米級)［8］，成像水平比靜態SIMS明顯提高，在微生物生態學中的應用也日漸成熟。

法國CAMECA公司生產的NanoSIMS 50L型是當前最為先進的動態二次離子質譜［9］，相比于傳統的離子探針具有極高的靈敏度和空間分辨率，其中銫(Cs+)離子源的分辨率達到50 nm，氧(O-)離子源的分辨率達到150 nm，并且具有極高的質量分辨率，如能夠有效區分13C-與12C1H-、12C15N-與13C14N-之間的細微質量差異，并且能夠同時對7種離子進行成像分析和精確定量［10］。CAMECA NanoSIMS 50L與傳統的二次離子質譜儀的工作原理非常相似，都是通過用一次離子束轟擊的方式激發樣品表面產生二次離子，進而分析樣品表面元素同位素組成和豐度［11］。具體工作流程為:首先將離子源(Cs+或者O-)產生的一次離子在真空加速器中加速形成具有幾千電子伏特(KeV)的離子束，當這些高能量的離子束聚焦并轟擊固體薄片樣品表面(微生物細胞)時，濺射出樣品中的二次離子，這些具有不同荷質比的二次離子由于在磁場中偏轉半徑不同而到達多接收器的不同位置，然后通過接收器上的法拉第環或者電子倍增器測量不同離子的強度，進而成像并通過圖像定量分析軟件計算出樣品表面的元素同位素的豐度和組成信息(圖 1)。測定的同位素比值信息(例如13C-/12C-)不僅可以用于計算單細胞的元素吸收速率，還可以表征元素的代謝途徑［12］。選擇合適的離子源對于正確分析樣品信息極為關鍵，銫(Cs+)離子源激發的負二次離子可以用來分析C、CN、P、S、O、H和鹵族元素等，一般在微生物生態學研究中被廣泛采用，而氧(O-)離子源激發的正二次離子適合于進行金屬的表面分析［13］。

圖1 CAMECA NanoSIMS 50L型納米二次離子質譜儀工作原理示意圖［11］Fig．1 Schematic illustration of CAMECA NanoSIMS 50L ion microprobe［11］

2 納米二次離子質譜技術(NanoSIMS)應用于微生物生態學研究的技術路線

二次離子質譜技術(SIMS)在微生物生態學中的應用始于2001年。Orphan等首次利用FISH與SIMS結合的方法證實了海洋沉積物中存在厭氧甲烷氧化古菌，能夠代謝13C—CH4［14］。但當時對同位素組成分析和FISH顯影分析需在不同的儀器上完成，而且SIMS的橫向分辨率較低，不能有效地對微生物的細胞進行辨識［15-16］，最新的CAMECA NanoSIMS 50L型二次離子質譜儀有效克服了這一難題。應用NanoSIMS進行單細胞成像分析的主要步驟為:在實驗室微宇宙培養或原位條件下，將采集的環境樣品或可培養的微生物暴露在富含穩定性同位素(15N或13C等)或者放射性同位素基質的環境中，經過短期的同位素標記過程之后，將樣品進行固定、脫水，形狀不規則樣品需要用環氧樹脂包埋，絕緣的樣品(絕大多數微生物生態學研究樣品)需要進行導電鍍膜(Au，Pt，Au/Pd或者 C)處理［17］，制備成表面平整、符合儀器真空條件的薄片樣品進行NanoSIMS分析。為了鑒別環境樣品中的目標微生物，NanoSIMS需要與透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)、熒光原位雜交(FISH)、催化報告沉積熒光原位雜交(CARD-FISH)、鹵素原位雜交(HISH)、X射線能譜儀(EDS X-ray)等聯合使用來識別微生物的種類和功能(圖2)。

圖2 納米二次離子質譜分析微生物代謝功能活性的技術路線圖Fig．2 Schematic diagram of NanoSIMS to detect and image microbial metabolic activities

3 納米二次離子質譜技術(NanoSIMS)的應用實例

3．1 氮循環微生物

氮的生物地球化學循環主要由一系列微生物所驅動，識別并確定參與不同氮轉化途徑(包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用)的功能微生物是當前氮循環機制研究的核心問題之一［18-19］。NanoSIMS技術在氮循環過程方面的應用首先在固氮微生物的研究上取得進展(表1)。2006年，Lechene等首次利用NanoSIMS從單細胞水平上研究并確定了實驗室純培養的固氮菌株Teredinibacter turnerae的固氮特性［20］。2007年，Lechene等又對與一種名為Lyrodus pedicellatus的船蛆(Shipworm)體內共生的固氮細菌進行了定量研究［21］。由于船蛆本身的食物鏈中不包含氮元素，所以必須依靠與其共生的微生物提供氮源。Lechene等在實驗室培養條件下向含有船蛆Lyrodus pedicellatus的海水中注入穩定性同位素底物15N2，然后經過8d的暴露培養之后，先對樣品進行透射電子顯微鏡(TEM)掃描確定待研究的船蛆組織中共生固氮細菌的位置，通過NanoSIMS分析后發現固氮細菌及周圍組織均被15N所標記上，這直觀有力地提供了船蛆依賴固氮微生物獲取氮源的證據［21］。這些早期利用NanoSIMS技術研究固氮微生物細胞功能的例子顯示出單細胞成像技術的巨大應用潛力。

固氮微生物中另一類被廣泛研究的是絲狀藍藻，它們能夠同時固定N2和CO2，其較大的細胞個體與獨特的形態特征為NanoSIMS的應用提供了便利［22］。絲狀藍藻包括營養細胞和異型胞，但是過去由于研究手段的限制，對氮元素和碳元素在這些細胞內及細胞之間的轉運和流動并不清楚。Popa等通過結合高分辨率的NanoSIMS與穩定性同位素標記技術對絲狀固氮藍藻A．oscillarioides的研究發現，新固定的氮元素可以被異型胞快速轉運，并最終分配到營養細胞中去。此外，NanoSIMS還可以根據細胞組織不同的元素組成從亞細胞水平上進一步觀察絲狀藍藻A．oscillarioides體內的元素分布狀況［23］。另一個類似的通過NanoSIMS和TEM對固氮藍藻菌株Trichodesmium的研究發現了更為細致的13C和15N吸收的時空分布特征，其中CO2的固定速率在上午達到最高水平，而N2的固定速率則在下午達到最高水平，并且新固定的C和N主要貯存在藻青素顆粒中［24］。這些研究說明，將同位素標記技術與NanoSIMS和TEM成像技術聯合使用，能夠在探究微生物細胞的生理組成元素及其相關代謝和轉運過程方面發揮巨大作用。在最近的研究中它們用于分析兩種不同的絲狀藍藻Nodularia spumigena和Aphanizomenon sp．對于波羅的海(Baltic Sea)碳氮循環的重要性，同時結合微傳感器技術測定了兩種不同藍藻類群單細胞水平的氮固定和碳固定速率，從而能夠更加準確地估測不同碳氮微生物對全球碳氮循環的貢獻率［25-26］。

除了對實驗室純培養的固氮藍藻進行分析之外，NanoSIMS同樣也能夠用于分析環境樣品中的固氮微生物。最近，Foster等利用15N2同位素標記與NanoSIMS結合的方法首次對寡營養海水中的3種硅藻-藍藻共生體的單細胞固氮速率進行了測定，解決了過去由于技術手段限制不能夠將硅藻-藍藻共生體與其它固氮菌分離研究的難題［27］。Halm等通過FISH與NanoSIMS聯合使用，識別出在湖水厭氧層中發揮固氮作用的微生物主要是數量非常少的綠硫細菌Chlorobium sp．［28］。在更為復雜的河流沉積物樣品中，Dekas等運用這2項技術對具有甲烷厭氧氧化功能的古菌ANME-2和細菌DSS類群的聚合體進行了研究，在經過6個月的15N2同位素培養實驗之后，根據15N的吸收分布情況，發現這種聚合體中的ANME-2古菌具有固定氮氣的功能，并且能夠將固定的氮元素轉運給DSS細菌［29-30］。

近年來，隨著第一株具有氨氧化功能的古菌在實驗室獲得純培養，氨氧化古菌(AOA)作為除細菌以外硝化作用的主要參與者，成為當前微生物生態學研究的熱點之一［31］。奧地利維也納大學的Tourna等成功地從土壤中富集到了氨氧化古菌Nitrososphaera viennensis，該菌株只有在添加有低濃度丙酮酸的培養基中才能將轉化成為了驗證該菌是否利用丙酮酸中的C元素來合成細胞組織，他們在含有N．viennensis的培養基中加入13C標記的丙酮酸，在37°C培養10 d后運用NanoSIMS對樣品進行分析，發現大約有10%的C元素來自于13C-丙酮酸，其余的主要來自于對碳酸氫鹽的固定，證明N．viennensis具有化能自養和混合營養生長的潛能［32］。該項研究是首次將NanoSIMS技術用于氨氧化微生物，對于探索新發現的氨氧化古菌的生理代謝機制提供了新的思路。

3．2 碳循環微生物

近些年發展起來的鹵素原位雜交(HISH)與NanoSIMS聯用的技術能夠分析環境樣品中的微生物組成，并同時定量測定單細胞的代謝功能［33］。Musat等首先將這種聯用技術用于研究寡營養湖水中3種厭氧光合細菌 Chromatium okenii，Lamprocystis purpurea 和 Chlorobium clathratiforme對 H13和15的吸收特征［17］。他們通過實驗室短期的微宇宙培養發現，同種光合細菌的不同細胞表現出極大的代謝速率差異，不同類群光合細胞之間的差異更大。其中，僅占細胞總數0．03%的C．okenii貢獻了光合細菌碳吸收總量的70%和氮吸收總量的40%，這表明湖水中厭氧光合細菌的碳氮吸收過程主要是由一部分數量非常稀少的類群所完成的［17］。

NanoSIMS技術在碳循環微生物方面的另一類應用主要是對于甲基營養菌(包括甲醇營養菌和甲烷營養菌)的研究。Li等利用碘標記的寡核苷酸探針原位雜交與NanoSIMS結合的方法對生物反應器中甲醇營養菌的組成和功能進行了分析［34］。為了研究生物反應器系統中微生物吸收甲醇的機理，他們采用13C-甲醇培養采自生物反應器的樣品，厭氧培養25 d后，首先用以碘標記的針對細菌和古菌的特異性探針確定樣品里的微生物類群，然后將樣品固定用于NanoSIMS分析，結果發現古菌是生物反應器中吸收甲醇的主要功能微生物［34］。此外，Behrens等運用類似的方法發現了口腔生物膜上的Cytophaga-Flavobacterium類群吸收13C-氨基酸的功能［35］。

3．3 硫循環微生物

硫酸鹽還原菌(SRB)是硫元素生物地球化學循環過程的關鍵功能類群，經典的分子生物學研究手段已經對SRB的種群組成和豐度進行了深入研究，但尚不能在單細胞水平解析其生理代謝功能特征［36］。近期，美國研究者Fike等利用最新的NanoSIMS 50L型二次離子質譜儀，并結合CARD-FISH技術，成功地為解決這一問題提供了新的視角，識別出在高鹽環境下微生物墊中參與硫循環的主要微生物類群是Desulfobacteraceae科的硫酸鹽還原菌［37］。他們首先用外層包裹有35SO4的銀箔與微生物墊中可溶性的硫化物反應，由于硫化物與35SO4的氧化還原反應使硫化物中的34S固定在銀箔表面，然后通過NanoSIMS成像技術就能夠測定樣品中δ34S同位素的組成情況，從而計算出不同微生物墊深度上硫化物的濃度。NanoSIMS所生成的二維圖像表明，微生物墊中硫化物的濃度隨著深度的增加而減少，這種變化趨勢與利用CARD-FISH所測定的Desulfobacteraceae科的硫酸鹽還原菌豐度隨微生物墊深度的變化趨勢相吻合，說明Desulfobacteraceae科對微生物墊中硫化物的空間分布具有決定作用［37］。以往對于硫酸鹽還原菌的研究多停留在對其總的豐度和結構組成分布上，而通過使用NanoSIMS與CARD-FISH結合的方法能夠將微生物的空間分布與硫化物的空間分布聯系在一起，更容易識別硫酸鹽還原過程中的關鍵活躍類群。

3．4 其它方面的應用

NanoSIMS技術除了在氮、碳、硫等元素的生物地球化學循環研究中得到廣泛應用外，研究者們也在不斷拓展著NanoSIMS在微生物生態學方面的應用范圍。微生物的空間分布及其在土壤基質中的功能活性對于元素地球化學循環具有極為重要的影響，而且土壤的高度異質性為微生物提供了無數性質各異的微環境［38］，將土壤理化環境的異質性與其對生物過程的影響聯系起來是當今土壤微生物生態學的研究前沿之一［39］，然而過去的技術手段對于分析微生物與土壤基質接觸的生物物理界面無能為力。2007年，Herrmann等創新地將NanoSIMS運用于土壤微生物的活性與空間分布的研究，并同時觀察了土壤物理微環境對于微生物的影響［40］。他們首先將土壤中廣泛分布的 Pseudomonas fluorescens的純培養菌株(NCTC10038)在含有15的培養基中進行標記24 h后，混入土壤樣品中，然后用環氧樹脂固定并切片供NanoSIMS觀察。其中，28Si-離子成像圖用來表示土壤基質的組成，12C-成像圖表示樹脂的組成，12C14N-成像圖表示含氮有機質，12C15N-與12C14N-的比值(即15N/14N)可以表示15N-P．fluorescens的分布(圖3)。從NanoSIMS成像圖中，可以清晰地看到15N標記的P．fluorescens主要分布在土壤粒子的邊緣部分［40］。該項研究顯示出NanoSIMS在分析微生物在土壤中的微域分布及其與土壤基質相互作用方面的巨大可能性。類似的研究方法已經開始用于對土壤-微生物-植物相互作用的研究。Clode等利用NanoSIMS在原位狀態下研究了15N元素在土壤根際圈的轉運情況，并重點關注了植物細胞與根際微生物對N元素的相互競爭［41］。這種原位研究元素流動的高分辨率成像方法顯示了NanoSIMS在分析復雜土壤環境中微生物過程的優越性，而以往的此類研究只能主要依靠簡單的數學模型分析。NanoSIMS在微生物生態學方面的其它可能應用還包括:控制土壤礦物質表面磷肥固定的微生物機理，促進有機質在土壤中穩定化過程的微生物類群，土壤基質中微生物與特定礦物質的相互作用，土壤中目標微生物活躍類群的空間分布，影響微生物水平基因轉移的微觀尺度因素等［6］。

圖3 15N標記的P．fluorescens在樹脂包被的土壤基質中分布的NanoSIMS 成像圖［40］Fig．3 NanoSIMS images of the distributions of15N-lableled P．fluorescens in Araldite resin-embedded soil matrix ［40］(a)28Si-;(b)12C-;(c)12C14N-;(d)15N/14N ratio

4 使用NanoSIMS技術應注意的問題

4．1 樣品制備

樣品制備是NanoSIMS分析中極為關鍵的環節，因為NanoSIMS一般在超高真空環境中進行操作，因此制備的環境樣品必須充分脫水并且能夠承受真空。樣品脫水的方法一般包括化學固定液(如加入乙醇、甲醛或戊二醛等)［44］、低溫脫水［45］、環氧樹脂包埋等［24］。不同的脫水方法適用于不同樣品的 NanoSIMS分析，如果在樣品制備的過程中待分析的元素有可能發生轉移和流動，最好使用低溫脫水方法來固定樣品的形態，例如在研究固氮微生物的碳氮吸收途徑的時候［23-24］。對于形狀不規則的樣品最好用樹脂進行包埋，然后切成薄片狀以便進行NanoSIMS分析。甲醛固定液對于微生物細胞的蛋白質、脂質和核酸有非常有效的固定和脫水作用［46］，但是在固定的過程中也有可能引入微生物細胞中的12C，從而使NanoSIMS的分析出現一定的偏差。尤其是當NanoSIMS與熒光雜交技術如FISH、CARD-FISH和HISH聯用時，最好使用多聚甲醛對樣品進行脫水處理［17］。Peteranderl和Lechene比較了低溫脫水與化學固定對樣品制備的不同影響，發現化學固定導致二次離子12C-和12C14N-的產率降低，并且化學固定液有可能洗脫低分子量的細胞組織［45］。而Ploug等對這2種

脫水方法的研究表明，化學固定法并沒有顯著地影響待測樣品的元素組成［25］。

表1 納米二次離子質譜在微生物生態學方面的應用舉例Table 1 Examples of NanoSIMS applications in microbial ecology

4．2 微生物的識別

在NanoSIMS分析中，不同的二次離子能夠表征樣品的不同組成，因此如何正確地將離子成像信息與微生物類群聯系起來顯得非常關鍵。例如在固氮硅藻-藍藻共生體的研究中就會遇到類似的難題，因為共生藍藻細胞經常生長在硅藻的細胞壁與細胞膜之間，為有效區分這兩種不同微生物對N的吸收帶來較大困難，因此在NanoSIMS分析之前必須首先破壞去除硅藻的細胞壁，然后再進行下一步分析［27］。識別復雜環境樣品中的微生物類群也可以通過在NanoSIMS分析之前首先進行FISH或者CARD-FISH分析，以此確定微生物的組成和種類，但是將熒光原位雜交的圖像與NanoSIMS分析的圖像正確地聯系在一起也是非常艱難的工作。為了有效地對微生物進行識別，在NanoSIMS分析之前也最好輔之以TEM或者SEM等電子顯微鏡技術對樣品進行必要的基本特征分析，首先確定好適合NanoSIMS分析的感興趣區域，這樣可以節省大量的時間。例如在分析富含有機質的沉積物樣品中的微生物群落時，有機質濃度較高的區域往往也是微生物富集的區域，因此首先用電子顯微鏡確定有機質的分布區域，可以更加快速地找到目標微生物。

5 總結和展望

以NanoSIMS為代表的單細胞分析技術的興起為研究微生物生態學提供了嶄新的機遇，并且已經在參與氮、碳、硫等元素生物地球化學循環的微生物研究中顯示出前所未有的優勢和重要的應用前景。NanoSIMS不僅能夠提供微生物的生理生態特征信息，而且能夠確定并識別復雜環境樣品中的代謝活躍的微生物細胞，并將其類群信息與功能聯系起來，對于從微觀尺度上識別不同微生物群落在元素循環中的作用和在生態系統中的功能具有重要意義［22］。然而，NanoSIMS技術本身依舊存在很多問題:(1)在進行NanoSIMS分析時，如果選擇反映同位素富集的感興趣區域不合適，可能會影響對微生物功能的正確分析;(2)在制備可供NanoSIMS分析的樣品時，固定和脫水等過程可能會對微生物細胞的同位素組成造成一定的影響;(3)由于NanoSIMS一般與同位素標記技術聯合使用，標記過程中微生物交叉取食和同位素被稀釋的風險同樣也會影響后續的NanoSIMS分析結果。(4)由于FISH技術應用于復雜土壤樣品的難題，NanoSIMS與FISH聯用仍然很難區分不同類群土壤微生物的功能活性。當前微生物生態學的研究技術多基于PCR擴增，對環境微生物的認識以易于被PCR擴增出的優勢種群為主，對環境中豐度較低的稀有微生物種群認識嚴重不足，未來基于NanoSIMS的研究方法將有助于揭示自然環境豐度較低但發揮重要功能作用的微生物種群。同時，隨著原位雜交技術的進一步發展，結合不斷豐富的生物標志物，如脂類、DNA/RNA、蛋白質等，NanoSIMS將可能為研究微生物的類群和功能提供更為完整的信息。

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