β2糖蛋白Ⅰ單克隆抗體的制備與鑒定①

胥 亞 許國(guó)瑩 周 紅 解鴻翔 夏龍飛 劉敬敬 張曉蕾

(江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江212013)

抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome，APS)為一種非器官特異性自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性動(dòng)、靜脈血栓及習(xí)慣性流產(chǎn)［1］。APS患者血清中高滴度的抗磷脂抗體(Antiphospholipid antibody，APL)與其血栓形成密切相關(guān)。研究表明，β2糖蛋白Ⅰ(beta-2-glycoprotein I，β2GPⅠ)是APL的關(guān)鍵靶抗原，其與相應(yīng)抗體(anti-β2GPⅠ)形成復(fù)合物，在 APS病理過程中發(fā)揮重要作用［2，3］。β2GPⅠ是分子量約45～50 kD 的糖蛋白［4］，在血漿中濃度為 200 μg/ml左右，即 3 μmol/L，其結(jié)構(gòu)由 5個(gè)補(bǔ)體調(diào)控蛋白樣結(jié)構(gòu)區(qū)(I～V)組成，肝臟是主要合成部位［5］。最初發(fā)現(xiàn)循環(huán)中的β2GPⅠ的一部分與脂蛋白相關(guān)，因此，β2GPⅠ也稱作載脂蛋白H(apoH)。但是，目前的研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白H是個(gè)錯(cuò)誤名稱，β2GPⅠ與脂蛋白片段無(wú)關(guān)［6］。

近年來(lái)，β2GPⅠ及其抗體(anti-β2GPⅠ)在 APS病理機(jī)制中的作用受到極大關(guān)注。然而，β2GPⅠ /anti-β2GPⅠ促血栓形成的具體機(jī)制還未完全闡明。本研究從人血清中純化出β2GPⅠ并制備了anti-β2GPⅠ多克隆抗體［7，8］。鑒于單克隆抗體具有特異性強(qiáng)，靈敏度高和易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)制備單克隆抗體并分析其特性，為深入APS病理機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 主要材料及試劑 人血漿β2GPⅠ為本實(shí)驗(yàn)室制備，已鑒定其與標(biāo)準(zhǔn) β2GPⅠ特性相同［7，8］;antiβ2GPⅠ單克隆抗體(MAB1066)購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司;SP2/0細(xì)胞，HGPRT缺乏的骨髓瘤細(xì)胞系，由本室保存;BALB/c小鼠，6～8周齡，雌性，體重18～22克，用以提供免疫脾細(xì)胞和制備腹水單抗，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、HT(次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸)液和HAT(氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸)購(gòu)自Gibco公司;福氏完全佐劑與不完全佐劑、PEG1450、L-谷氨酰胺(L-G)、8-氮雜鳥嘌呤、Ig亞類鑒定試劑盒、牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma公司;羊抗鼠 IgGHRP購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;96孔、24孔培養(yǎng)板及酶標(biāo)板購(gòu)自Greiner公司;550型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;其它ELISA相關(guān)試劑由本室提供。

1．2 方法

1．2．1 小鼠免疫 將人血漿β2GPⅠ用生理鹽水稀釋后與等量福氏完全佐劑充分乳化后制成免疫原，頸背部皮下多點(diǎn)注射6周齡BALB/c雌性小鼠(50 μg/只)。以后每隔2周用福氏不完全佐劑與同等劑量β2GPⅠ乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫2～3次(50 μg/只，腹腔注射)。末次加強(qiáng)免疫后7天，小鼠斷尾取血，測(cè)免疫效價(jià)，選擇免疫效價(jià)高的小鼠于末次加強(qiáng)免疫20天，用生理鹽水稀釋同等劑量β2GPⅠ進(jìn)行尾靜脈加強(qiáng)(12．5 μg/只)，沖擊免疫后3 ～5 天內(nèi)眼球采血留樣，ELISA法測(cè)定免疫小鼠血清效價(jià);取脾細(xì)胞用于融合［9］。

1．2．2 細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞的克隆化 SP2/0細(xì)胞于融合前擴(kuò)大培養(yǎng)，挑選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于融合。小鼠摘眼球取血，留血清作陽(yáng)性對(duì)照，小鼠處死后取脾細(xì)胞，將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞以4∶1混合于融合管，離心，去上清，沉淀于37℃水浴中滴加1 ml 50%PEG1450，60秒內(nèi)均勻加完，立即于90秒內(nèi)滴加30 ml無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)，37℃水浴中靜置10分鐘，離心去上清，融合細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基稀釋后鋪入加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后開始觀察克隆生長(zhǎng)情況，第4天用HAT培養(yǎng)基半量換液，7天左右用HT培養(yǎng)基完全換出孔中HAT培養(yǎng)基。采用間接ELISA法進(jìn)行篩選，陽(yáng)性孔轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)凍存，同時(shí)用有限稀釋法進(jìn)行3～4次亞克隆，至陽(yáng)性率達(dá)100%擴(kuò)大培養(yǎng)，建株保存［10］。

1．2．3 間接 ELISA 法檢測(cè) anti-β2GPⅠ抗體 β2GPⅠ用0．05 mol/L pH9．6的碳酸鹽溶液稀釋后包被酶標(biāo)板，封閉液為含10%小牛血清的0．02 mol/L pH7．4 PBS。以正常鼠血清1∶1 000作為陰性對(duì)照，以β2GPⅠ免疫鼠的多抗血清1∶2 000作為陽(yáng)性對(duì)照，用方陣滴定法確定包被抗原和酶標(biāo)記抗體(羊抗鼠IgG-HRP)的最佳組合。結(jié)果判定:樣品吸光度(A)值大于陰性對(duì)照A值的2．1倍判為陽(yáng)性。

1．2．4 單克隆抗體的制備及純化 取10～12周齡BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟(0．5 ml/只)，7～10天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞［(0．5～1)×106/只］，7～14天左右抽取腹水，分裝后貯存于－70℃冰箱。采用硫酸銨沉淀及 Protein G純化腹水，以 SDSPAGE鑒定純度。按經(jīng)驗(yàn)公式:蛋白濃度(mg/ml)=1．45×A280-0．74×A260，計(jì)算純化前后的蛋白濃度和收獲率。SDS-PAGE按常規(guī)方法操作，12%分離膠，5%濃縮膠，抗體濃度1 mg/ml，與等量的還原型加樣緩沖液混合，100℃ 5分鐘，25 μl/孔上樣，恒定電流50 mA電泳，0．25%考馬斯亮藍(lán)染色，進(jìn)行蛋白掃描。

1．2．5 單克隆抗體的鑒定 用秋水仙素阻抑法獲得較多的分裂中期的雜交瘤細(xì)胞，再經(jīng)低滲，固定處理后，用10%Giemsa染液染色，鏡下觀察染色體;用間接ELISA法測(cè)定腹水效價(jià);用單克隆抗體亞類鑒定試劑盒鑒定Ig亞類(按說明書操作);用Western blot鑒定MAbs的特異性:用加樣緩沖液將β2GPⅠ配制成1 mg/ml，12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，再以350 mA恒流轉(zhuǎn)印至PVDF膜;膜置于含有5%脫脂牛奶的 TBS/T室溫封閉1小時(shí);將膜分別與1∶1 000稀釋的各株β2GPⅠ單抗及標(biāo)準(zhǔn)β2GPⅠ單抗反應(yīng)，次日用 TBS/T洗滌3次，15 min/次，采用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1∶2 000)，37℃孵育1小時(shí)，TBS/T洗滌3次，15 min/次，ECL顯色系統(tǒng)定影顯色，觀察雜交條帶。

1．2．6 雜交瘤細(xì)胞株的鑒定 復(fù)蘇液氮罐中凍存6個(gè)月的細(xì)胞株，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后將細(xì)胞通過腹腔注射BALB/c小鼠，收集腹水測(cè)其對(duì)β2GPⅠ的ELISA滴度，觀察雜交瘤細(xì)胞分泌anti-β2GPⅠ單抗的穩(wěn)定性;染色體檢查按常規(guī)方法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2．1 anti-β2GPⅠ單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立一共免疫兩批小鼠，每批5只，于末次加強(qiáng)免疫后7天斷尾取血，ELISA檢測(cè)小鼠免疫效價(jià)，發(fā)現(xiàn)第2批5號(hào)小鼠免疫效果最好，免疫效價(jià)為1．0×104。經(jīng)細(xì)胞融合、篩選和反復(fù)克隆化，最終獲得1株穩(wěn)定傳代、分泌anti-β2GPⅠ抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為:β2。細(xì)胞在體外連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月后，其培養(yǎng)上清效價(jià)沒有變化，表明這細(xì)胞已成為穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞系。

2．2 間接 ELISA檢測(cè)anti-β2GPⅠ抗體 最佳條件為:1 μg/ml β2GPⅠ包被酶標(biāo)板，羊抗鼠 IgG-HRP工作濃度 1∶10 000。

2．3 腹水單抗制備及抗體純化結(jié)果 雜交瘤細(xì)胞注射BALB/c小鼠，注射4只，共收集腹水約20 ml，所得腹水用硫酸銨法及 Protein G純化后，SDSPAGE分析結(jié)果見圖1，泳道為還原條件下電泳結(jié)果，分別為免疫球蛋白重鏈(約50 kD)和輕鏈(約25 kD)，腹水單抗的純度在90%以上。

圖1 純化MAbs β2的12%SDS-PAGE分析Fig．1 SDS-PAGE analysis of purified MAbs β2

圖2 雜交瘤細(xì)胞染色體分析Fig．2 Analysis of hybridism's chromosome

2．4 單克隆抗體鑒定 染色體鑒定結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目多于SP2/0細(xì)胞的51條，在99～108條之間(圖2)。間接ELISA法結(jié)果顯示雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和純化后的腹水單抗對(duì)β2GPⅠ的滴度分別為1∶29和1∶215。對(duì)MAbs的類及型別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示細(xì)胞分泌 IgG1/κ型抗體(圖3)。Western blot法進(jìn)一步分析了雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗對(duì)β2GPⅠ的反應(yīng)性，以購(gòu)置的標(biāo)準(zhǔn)β2GPⅠ單抗作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果見圖4。圖4A為本次制備anti-β2GPⅠ單抗反應(yīng)結(jié)果，結(jié)果顯示單抗與PVDF膜上約45 kD的β2GPⅠ抗原發(fā)生反應(yīng)，與67 kD處的BSA無(wú)明顯反應(yīng)，說明單抗只識(shí)別β2GPⅠ，特異性好，圖4B為標(biāo)準(zhǔn) anti-β2GPⅠ單抗反應(yīng)(陽(yáng)性對(duì)照)。

2．5 雜交瘤細(xì)胞的鑒定 雜交瘤細(xì)胞體外連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月后注射小鼠腹腔，采集腹水以間接ELISA法測(cè)其效價(jià)，效價(jià)保持穩(wěn)定。凍存于液氮罐半年以上的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇擴(kuò)大培養(yǎng)后注射小鼠腹腔，采取腹水用間接ELISA法測(cè)其效價(jià)，效價(jià)保持穩(wěn)定。

圖3 MAbs的亞類鑒定(試紙條法)Fig．3 Isotypes of MAbs to β2GPⅠ

圖4 anti-β2GPⅠ單抗特異性分析(Western blot)Fig．4 Western blot analysis of MAbs to β2GPⅠ

3 討論

本研究用本室制備的β2GPⅠ成功建立了分泌anti-β2GPⅠMAbs的雜交瘤細(xì)胞株，其染色體數(shù)為99～108條之間，為小鼠脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞之和。其分泌的MAbs亞類為IgG1/κ，專一性地針對(duì)β2GPⅠ分子的抗原決定簇，具有較高的特異性。應(yīng)用該技術(shù)制備的單抗與多抗相比，具有純度高、專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、能持續(xù)的無(wú)限量供應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。目前anti-β2GPⅠ抗體市場(chǎng)上雖有國(guó)外供應(yīng)，但本實(shí)驗(yàn)室用量大，成本高，因此自制anti-β2GPⅠ單抗對(duì)本實(shí)驗(yàn)室研究抗磷脂綜合征具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。研究表明，anti-β2GPⅠ抗體識(shí)別β2GPⅠ的I區(qū)與血栓形成相關(guān)［11，12］。Agar 等［13］發(fā)現(xiàn)存在兩種形式的 β2GPⅠ:循環(huán)血漿形式和激活開環(huán)形式，當(dāng)改變pH及鹽濃度時(shí)，循環(huán)血漿形式變成開環(huán)形式，I區(qū)暴露，更有利于anti-β2GPⅠ抗體識(shí)別β2GPⅠ。為了更好地應(yīng)用anti-β2GPⅠ單抗，還有必要進(jìn)一步分析該抗體識(shí)別的抗原表位。β2GPⅠ單克隆抗體可廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，臨床疾病診斷等方面，該抗體的制備對(duì)于基礎(chǔ)及臨床研究均具有重要意義。

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