海洋鏈孢囊菌FIM09-1157產生的神經氨酸酶抑制劑

彭 飛，王傳喜，江宏磊，江寧宇，謝 陽，陳路劼，江 紅，連云陽

福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福州 350007

放線菌是生物活性物質的重要來源，隨著從鏈霉菌(Streptomyces sp.)中發現新活性物質概率的降低，稀有放線菌［1］逐步成為關注的熱點，如Nocardia、Micromonospora、Microbispora、Saccharothrix、Streptosporangium 等［2，3］。鏈孢囊屬(Streptosporangium)放線菌作為一類稀有放線菌，其產生的許多次級代謝產物因具有抗菌、抗腫瘤等廣泛的生物學活性而備受關注，如 platomycins［4］、sibiromycin［5］、sinefungin［6］。

本實驗室從海洋沉積物中分離篩選出一株放線菌FIM09-1157，其發酵代謝產物具有抑制神經氨酸酶活性。本文采用形態學描述和16S rDNA序列分析對該菌株進行初步分類學研究，同時利用各種化學分離技術從放線菌FIM 09-1157發酵液中獲得活性代謝產物T1并進行結構解析，研究其體外神經氨酸酶抑制活性。

2 材料和方法

2.1 儀器與材料

AV-400核磁共振儀(美國Bruker公司)，TMS為內標;質譜儀(Aligent Quattro Premier Triple Quadrupole mass spectrometer);高效液相色譜儀(SHIMADZU 20A-DAD);Agilent ultimate XB-C18色譜柱(10 × 250 mm，5 μm);Sephadex LH-20(Pharmacia公司);柱色譜硅膠(200～300目)和硅膠H及薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠);神經氨酸酶抑制劑篩選試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

2.2 菌種來源

FIM09-1157來自于福建省微生物研究所菌種保藏中心，從臺灣海峽的海泥樣品中分離得到，其發酵代謝產物具有神經氨酸酶抑制活性。

2.3 菌株FIM 09-1157分類學研究

形態觀察:菌株FIM09-1157的孢子懸液在高氏-天冬素瓊脂平板上劃線，同時斜插無菌蓋玻片，35℃培養，分別于5、10、20天取出蓋玻片，在光學顯微鏡及電鏡下觀察菌絲及孢子形態特征。

16S rDNA序列分析:菌株總DNA提取采用劉志恒等人的方法［7］。以總DNA為模板，引物序列如下:27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3';1492r:5'-tacggctaccttgttacgactt-3'，Tag酶進行PCR擴增。擴增程序采用:94℃預變性2 min，94℃變性40 s，54℃退火40 s，72℃延伸3 min，共30個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物的測序由北京泰京生物有限公司完成。測序結果在NCBI進行BLAST比對，再通過軟件Clustalx(version 1.8)對擴增序列和GenBank中近緣典型菌種的序列進行比對，用MEGA4.1構建系統發育樹。

2.4 培養基和發酵培養條件

斜面培養基采用含1%NaCl的ISP-3，成熟的培養物從斜面培養基中接入種子培養基:可溶性淀粉15 g;葡萄糖5 g;蛋白胨5 g;酵母粉5 g;K2HPO40.5 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;CaCO31 g;NaCl 0.5 g;(NH4)2SO40.5 g;H2O 1000mL;pH7.5;28℃ 220 rpm培養72 h，以8%接種量轉接發酵培養基:可溶性淀粉40 g;葡萄糖5 g;黃豆餅粉20 g;蛋白胨5 g;燕麥 5g;NaCl 0.5 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;K2HPO40.5 g;CaCO31 g;H2O 1000 mL;pH7.5;28 ℃ 220 rpm培養120 h。

2.5 分離純化方法

放線菌FIM09-1157發酵液40 L，4500 rpm離心15 min得上清液。菌絲體用3倍體積的甲醇浸泡2 h，離心后用水稀釋成20%的甲醇浸泡液，上述兩部分合并經大孔吸附樹脂HP-20吸附，甲醇洗脫，洗脫液減壓濃縮蒸干，加入適量的乙酸乙酯溶解提取3次，合并乙酸乙酯溶液，蒸干得粗品。

粗品用甲醇溶解后硅膠拌樣，上硅膠柱，氯仿-甲醇梯度洗脫，神經氨酸酶活性檢測跟蹤，TLC分析合并相同活性餾份，濃縮后采用Sephadex LH-20凝膠分離，氯仿:甲醇(1∶1)洗脫，活性與TLC跟蹤，活性餾份進一步經反相C18色譜柱層析(5% ～100%甲醇-水梯度洗脫)和半制備HPLC(ultimate XB-C18，5 μm，10 ×250 mm，甲醇:1‰氨水 =1∶4，238 nm)純化，得到化合物 T1(40mg，tR=25 min)。

2.6 抑制神經氨酸酶活性測試方法

采用96孔熒光酶標板測定，每孔依次加入70 μL神經氨酸酶檢測緩沖液，10 μL神經氨酸酶(0.3 U/mL)，5 μL待測樣品(對照孔以緩沖液代替)和5 μLMilli-Q水。振動混勻1 min，37℃孵育2 min，每孔再加入10 μL神經氨酸酶特異性熒光標記底物(80 mmol/L)，振動混勻1 min，37℃孵育20 min后用M5多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)測定熒光強度(F)。激發波長為360 nm，檢測波長為440 nm。

計算樣品對神經氨酸酶的抑制率和半數抑制濃度。公式:抑制率(%)=(F對照-F樣品)/F對照×100%。

3 結果與分析

3.1 菌株FIM09-1157分類學研究

菌株FIM09-1157接種在含1%NaCl的燕麥瓊脂上，28℃培養20 d后，菌落呈圓形，直徑約1～3 cm，邊緣整齊，菌落隆起，表面稍皺折，菌落表面被一層粉紅色粉狀的孢子層覆蓋，基絲的顏色為深粉紅色(Deep Pink)，菌落周圍未見可溶性色素產生?；z生長豐富，分枝較少，無橫隔，不斷裂，氣絲上有孢囊形成，孢囊圓形，直徑5 ～8 μm(圖1)。

圖1 菌株FIM09-1157掃描電鏡菌絲形態(ISP9+蜜二糖瓊脂28℃培養30 d)Fig.1 Scanning electron micrograph of strain FIM 09-1157 grown on ISP9+melibiose at 28 °C for 30 days.(Bar，10 μm)

測得菌株FIM 09-1157的16S rDNA序列1415 bp(Accession number:JQ910638)與 Genebank中基因序列進行Blast比對，結果發現該菌與Streptosporangiumvulgarestrain ATCC 33329同源性最高，達到99%。采用Neighbor-Jointing法構建FIM 09-1157與近緣典型菌株的16S rDNA系統進化樹(圖2)。菌株FIM 09-1157 與鏈孢囊菌 S.vulgarestrain ATCC 33329、S.purpuratum strain CY-15110 以及 S.yunnanense strain CY-11007處于同一個分枝。16S rDNA序列分析表明菌株FIM 09-1157屬于鏈孢囊菌(Streptosporangium)，暫定名 為StreptosporangiumFIM 09-1157。

圖2 FIM09-1157與相關典型菌株的16S rRNA系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the16S rDNA sequences of strain FIM09-1157 and representative species of the genus Streptosporangium(Bootstrap values are shown as percentages at each node)

3.2 化合物T1的結構鑒定

化合物T1為白色粉末。其甲醇溶液在239 nm和302 nm處有特征UV吸收。ESI-MS:m/z 239［M+H］+，1H-NMR，13C-NMR，1H-1H COSY 以及 HMBC數據如表1所示。綜合分析化合物T1紫外、質譜及核磁等光譜學數據，結合文獻［8］，確定化合物T1為硫內酯類化合物Thiotetromycin?；瘜W結構見圖3。

表1 T1的核磁共振數據表Table 1 The NMR spectral data of compound T1

圖3 化合物T1的結構Fig.3 Chemical structure of compound T1

3.3 活性結果

活性篩選發現化合物T1體外具有抑制神經氨酸酶活性，其半抑制濃度 IC50值為92 μmol/L，而神經氨酸酶抑制劑扎那米韋［11］的半抑制濃度IC50值為246.3 μmol/L。當濃度達到210 μmol/L 時，化合物T1對神經氨酸酶的抑制率達到96%。

4 討論

已發現鏈孢囊菌(Streptosporangium sp.)能夠產生許多結構新穎的活性代謝產物，如Spoxazomicins［9］。本文首次從鏈孢囊菌(Streptosporangium sp.)代謝產物中篩選到硫內酯類抗生素Thiotetromycin，進一步說明了鏈孢囊菌產生次級代謝產物的多樣性。

抗生素Thiotetromycin［8］是1983年日本科學家從鏈霉菌(Streptomyces sp.)的發酵液中分離得到。結構研究發現化合物T1與Thiotetromycin同質，與另一個具有共軛二烯以及5元硫內酯環結構的化合物Thiolactomycin［10］結構相似，兩者僅在內酯環側鏈基團上有微小差異(前者為乙基，而后者的側鏈基團是甲基)。本文首次報道Thiotetromycin具有神經氨酸酶抑制活性，其活性強于目前臨床使用的神經氨酸酶抑制劑扎那米韋，說明此類物質可能具有潛在的抗病毒活性。本項研究發現了硫內酯類化合物新的生物學活性，為從硫內酯類化合物中發現結構新穎的神經氨酸酶抑制劑奠定基礎。

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2 Sanglier JJ，Haag H，Huck TA，et al.Review of actinomycetes compounds 1990-1995.Exp Opin Invest Drugs，1996，5:207-223.

3 Lamari L，Zitouni A，Boudjella H，et al.New dithiolopyrrolone antibiotics from Saccharothrix sp.SA 233.I.Taxonomy，fermentation，isolation and biological activities.J Antibiot(Tokyo)，2002，55:696-701.

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6 Cooper R，Das P，Federbush C，et al.Characterization of peptidyl-nucleoside antifungalantibiotics from fermentation broth.J Ind Microbiol，1990，5:1-8.

7 Liu ZH(劉志恒)，Jiang CL(姜成林).Modern biology and biotechnology of actinomycete(放線菌現代生物學與生物技術).Beijing:Science Press，2004.293-295.

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10 Sasaki H，Oishi H，Hayashi T，et al.Thiolactomycin，a new antibiotic.II.Structure elucidation.J Antibiot(Tokyo)，1982，35:396-400.

11 Zhang F(張博)，Fu J(付杰)，Zhou YD(周永達)，et al.Researches on influenza neuraminidase inhibitors.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2009，21:253-257.