超聲輔助提取華細辛揮發(fā)油中甲基丁香酚工藝優(yōu)化

歐陽天贄，袁 泉

武漢理工大學理學院化學系，武漢 430070

細辛為我國傳統(tǒng)中藥，最早可見于《神農本草經(jīng)》，具有鎮(zhèn)痛、抗炎［1］、抑菌［2］等功效。研究表明，細辛中含有約幾十種化學成分，其中甲基丁香酚的含量最高［3-5］，是多種植物揮發(fā)油的化學成分之一［6］。主要作為調味品用于多種食品中［7］。還可用于化妝品、肥皂、洗發(fā)劑、香水中［8］。研究表明甲基丁香酚具有抗過敏、抗組胺、麻醉、降血壓、抗抑郁、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性［9-11］。

目前對細辛揮發(fā)油中甲基丁香酚的研究多集中于定量分析［12-14］，提取方法多采用傳統(tǒng)提取法，超聲輔助提取法(ultrasonic assisted extraction，UAE)的運用可提高細辛揮發(fā)油的提取效率［15］。本實驗通過研究超聲輔助提取過程中料液比、浸泡時間、提取溫度、提取時間對甲基丁香酚得率的影響，在單因素實驗的基礎上，建立L9(34)正交試驗，優(yōu)化超聲輔助提取華細辛揮發(fā)油中甲基丁香酚的工藝條件，為華細辛的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

細辛購于湖北省武漢市藥材市場(產地:湖北恩施)，經(jīng)華中農業(yè)大學植物科學技術學院張宏宇教授鑒定為華細辛(Asarum sieboldii Miq.)的干燥根莖。樣品經(jīng)粉碎后密封保存待用;甲基丁香酚標準品為美國Accustandard公司;其它試劑均為國產分析純。

KQ5200E超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司);Agilent 6890N氣相色譜儀(美國);FA2204B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 GC 分析條件

色譜柱:安捷倫DB-35MS毛細管色譜柱(30 m× 0.32 mm × 0.25 μm);升溫程序:初始溫度 100℃，保持1 min，以20℃/min升到160℃，5℃/min升到190℃，20℃/min升到220℃保持5 min;進樣口溫度:220 ℃;檢測器:250 ℃;進樣量:0.5 μL。分流比:10∶1。

1.2.2 精密度考察實驗

取8批樣品，每批樣品測定兩次甲基丁香酚的質量分數(shù)，通過絕對極差和相對極差推算出測定相對標準偏差，判斷儀器的精密度。

1.2.3 回收率試驗

提取樣品中加入一定量的甲基丁香酚的正辛醇標準溶液后，測得甲基丁香酚的質量分數(shù)，計算加入標準溶液后的甲基丁香酚質量百分數(shù)理論值，由此計算得到甲基丁香酚的回收率。

回收率=(加標試樣測定值-試樣測定值)÷加標量×100%

1.2.4 甲基丁香酚標準儲備液的制備和標準曲線的制作

電子天平上去皮后準確稱取甲基丁香酚標準品0.0131 g，用移液管加甲醇定量至 1.8040 g，搖勻得到質量分數(shù)為7.3%的甲基丁香酚標準溶液。

正辛醇甲醇溶液的配制:取1.67 mL正辛醇和18.33 mL甲醇溶液混合而成20 mL體積分數(shù)為8.4%的正辛醇甲醇溶液。

分別取上述甲基丁香酚標準溶液 0.0686、0.1452、0.2754、1.0000 g，分別用甲醇定量至1.0000 g，配制成甲基丁香酚質量分數(shù)分別為0.05、0.10、0.20、0.73% 的梯度溶液，分別加入 20 μL 體積分數(shù)為8.4%的正辛醇甲醇溶液，按實驗設定的方法分別進行GC測定，以甲基丁香酚質量分數(shù)對甲基丁香酚與正辛醇的峰面積比進行線性回歸分析，得回歸方程為Y=6.446X+0.0229(Y是甲基丁香酚與正辛醇的峰面積比，X是甲基丁香酚質量分數(shù))，R2=0.9997，對照品質量分數(shù)在0.05 ～0.73%范圍內與峰面積比有良好的線性關系。

1.2.5 甲基丁香酚的提取

準確稱取1.0 g細辛根粉末，置于100 mL錐瓶中，按料液比1∶40加入甲醇溶液，超聲提取15 min，過濾。濾渣以相同的條件再提取一次，過濾后合并濾液，水浴40℃條件下用旋轉蒸發(fā)儀旋轉蒸發(fā)儀旋干甲醇溶液后，40℃真空干燥1 h，用1.00 g甲醇溶解，準確加入20 μL前述配制正辛醇甲醇溶液，微孔濾膜過濾，氣相色譜分析，選取正辛醇作為內標物內標法定量。

根據(jù)標準曲線方程求出提取物中甲基丁香酚的質量，按下面方法計算甲基丁香酚的得率:

甲基丁香酚得率=甲基丁香酚質量/華細辛質量×100%

1.2.6 單因素實驗

考察不同料液比(g/mL)、浸泡時間、提取溫度、提取時間對華細辛揮發(fā)油中甲基丁香酚得率的影響。按照1.2.2所需方法進行后處理和分析獲得得率。

1.2.7 正交試驗

根據(jù)單因素實驗的結果對料液比、浸泡時間、提取溫度、提取時間這四個單因素實驗參數(shù)進行篩選，按照每一個因素對提取影響的大小順序，，建立正交試驗因素水平表。根據(jù)因素水平表由正交設計助手Ⅱ軟件建立L9(34)正交試驗。按照上述同樣方法后處理和分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 內標物選擇和方法專屬性實驗

分別對甲基丁香酚的正辛醇對照品溶液及1.2.4法提取的樣品溶液進行GC分析，所得氣相色譜圖分別如圖1，圖2所示。

由圖1中可知甲基丁香酚的保留時間為6.611 min，其它組分對測定無干擾。

在所選試劑正丁醚、二甲苯、環(huán)己酮、正辛醇中僅正辛醇符合作為內標物的要求，加入正辛醇的萃取物樣品溶液GC分析氣相色譜圖見圖3。

圖3 細辛提取樣中加入正辛醇的氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of octanol in A.Sieboldii extract

2.1.2 精密度實驗

取8批1.2.4法提取的樣品，每批樣品測定兩次，測定結果如表1所示。表1中，N為批次號，A1、A2為測定的甲基丁香酚的質量分數(shù)，A為甲基丁香酚質量分數(shù)的平均值，R為絕對極差(=最大值-最小值)為相對極差(=R/A×100%)。相對極差平均值=2.52%，根據(jù)相對極差平均值可推算出測定相對標準偏差:

表1 精確度校核實驗結果Table 1 Results of the precision tests

式中，1/d2為由極差估算標準偏差的系數(shù)，對于成對試驗為0.8865。樣品中甲基丁香酚質量分數(shù)在2‰ ～5‰之間，測定的相對標準偏差為2.23%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 回收率實驗

加標前提取樣品中甲基丁香酚的質量分數(shù)為0.419%，加入一定量的甲基丁香酚的正辛醇標準溶液后，測得甲基丁香酚的質量分數(shù)為0.490%，加入標準溶液后的甲基丁香酚質量百分數(shù)理論值是0.487%，因此，計算得到甲基丁香酚的回收率為104%，回收率符合實驗要求。

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對甲基丁香酚得率的影響

圖4 料液比(g/mL)對甲基丁香酚得率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of methyl eugenol

圖4為浸泡時間4 h、提取溫度40℃、提取時間15 min的條件下，不同料液比對甲基丁香酚得率的影響。由圖4可知，隨料液比增加，甲基丁香酚得率變大。當料液比達到1∶40時提取率趨于穩(wěn)定。

超聲振蕩下，提取溶劑量越大，浸潤和滲透速度越快，化學成分溶解速率和擴散速度越大，提取率越高，當溶劑達到一定量時，浸出化學物質趨于飽和。考慮成本和環(huán)境友好，選擇料液比1∶40進行以下單因素實驗。

2.2.2 浸泡時間對甲基丁香酚得率的影響

圖5 浸泡時間對甲基丁香酚得率的影響Fig.5 Effect of the immersion time on extraction rate of methyl eugenol

圖5為料液比1∶40、提取溫度40℃、提取時間15 min的條件下，不同浸泡時間對甲基丁香酚得率的影響。由圖5可知，浸泡時間達到5 h的時候，甲基丁香酚提取率達到最大值，隨后下降。

超聲輔助提取中，提取溶劑滲透到細胞內并將有效化學成分溶解，由于濃度差關系，溶解的化學成分擴散到提取溶劑中，但有醇溶性雜質、色素等非有效成分同時溶解并擴散出來，與有效成分的擴散過程競爭，導致有效成分的擴散速率降低，提取率下降。選擇浸泡5 h進行以下單因素實驗。

2.2.3 提取溫度對甲基丁香酚得率的影響

圖6 提取溫度對甲基丁香酚得率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction rate of methyl eugenol

圖6為料液比1∶40、浸泡時間5 h、提取時間15 min的條件下，不同提取溫度對甲基丁香酚得率的影響。由圖6可知，提取溫度從20℃升高到60℃時，甲基丁香酚得率升高，60℃ 時達到最高，隨后開始下降，70℃后保持穩(wěn)定。

超聲輔助提取過程中，溫度升高導致超聲空化作用產生的沖擊波沖向物料，引起物料內部細胞結構變化，促使提取溶劑進入植物組織細胞內的速度和化學成分的溶解增大，因此，隨著溫度的升高，甲基丁香酚得率迅速升高。由于植物中的某些化學成分熱穩(wěn)定性差，隨溫度過高而分解，導致得率下降到一定值后穩(wěn)定。所以選擇60℃進行以下單因素實驗。

2.2.4 提取時間對甲基丁香酚得率的影響

圖7 提取時間對甲基丁香酚得率的影響Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate of methyl eugenol

圖7為料液比1∶40、浸泡時間5 h、提取溫度60℃的條件下，不同提取時間對甲基丁香酚得率的影響。由圖7可知，隨著提取時間的逐漸增加，甲基丁香酚的得率增大，當超聲提取35 min之后，得率變化緩慢并趨于穩(wěn)定。

超聲振蕩下，提取溶劑首先通過細胞壁進入到細胞內，然后溶解細胞內的化學成分，再擴散出細胞外進入提取溶液中，過程復雜。所以，隨提取時間增大，進入到細胞內的提取溶劑越多，溶解化學成分的速度越快，擴散速度也增大，得率隨之增大。達到一定提取時間后，細胞內化學成分已被充分提取出來，得率不再增加。

2.3 正交實驗

根據(jù)單因素實驗的結果，建立正交實驗因素水平表如表2所示。

表2 正交實驗因素與水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

根據(jù)表2由正交設計助手Ⅱ軟件建立L9(34)正交實驗，通過正交實驗對超聲輔助提取華細辛揮發(fā)油中甲基丁香酚的工藝條件進行優(yōu)化，實驗結果見表3。

從表3中直觀分析可知RA＞RC＞RD＞RB。即四個因素中料液比對揮發(fā)油提取率的影響最大，其次是提取溫度和提取時間，浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響最小。

可知UAE法提取華細辛揮發(fā)油中甲基丁香酚的最佳工藝條件為A3B1C2D3，即料液比1∶40、浸泡時間3 h、提取溫度60℃、提取時間40 min。

2.4 驗證實驗

按上述UAE法提取的最佳工藝條件，重復提取華細辛揮發(fā)油中甲基丁香酚3次，甲基丁香酚得率分別為 0.662%、0.657%、0.665%，平均得率為0.661%，絕對偏差分別為:0.001、-0.004、0.004，相對偏差分別為:0.151%、-0.605%、0.605%。此條件下的甲基丁香酚得率比正交試驗任意組的得率高。

3 結論

采用超聲輔助提取法提取華細辛揮發(fā)油中甲基丁香酚并采用內標法定量分析，分別考察料液比、浸泡時間、提取溫度、提取時間等因素對甲基丁香酚得率的影響，在單因素實驗基礎上，采用正交實驗優(yōu)化了甲基丁香酚的超聲提取工藝條件，結果表明最佳提取條件為:浸泡時間為3 h，料液比為1∶40，提取溫度為60℃，在此條件下，UAE法提取華細辛揮發(fā)油中甲基丁香酚需40 min，此條件下平均得率為:0.661%。

表3 甲基丁香酚提取工藝正交實驗結果Table 3 Results of orthogonal test

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