汽爆玉米秸稈糖化及發酵丁醇工藝的優化研究

劉利平，申利英，常 春

(鄭州大學化工與能源學院，河南鄭州450001)

0 引言

能源短缺與環境污染，使新型生物能源的開發勢在必行.丁醇因其具有能量密度高、易與汽油混合等特點，而成為替代石油的重要選擇［1］.秸稈是地球上最豐富廉價的資源，以秸稈為原料制備生物丁醇在解決糧食、能源、環境污染等問題中具有重要的作用.

微生物無法直接利用秸稈為底物進行丁醇發酵，需將其水解產生葡萄糖、木糖等單糖后再用于丁醇發酵［2］.而水解后還原糖含量直接影響到丁醇的產量.但目前，對經蒸汽爆破預處理的玉米秸稈為原料，進行糖化和丁醇發酵工藝研究的報道較少.李冬敏等［3］用汽爆玉米秸稈進行丁醇發酵，丁醇濃度達到了6.52 g/L.其丁醇含量較低，難以滿足規模化應用的條件.因此，本研究嘗試首先通過對汽爆玉米秸稈的糖化工藝進行考察，篩選出較佳的糖化工藝，并在此基礎上，分別對溫度、pH值、底物濃度、纖維素酶用量、菌種種齡及接種量、培養基的組成和發酵時間8個方面進行丁醇發酵工藝條件的試驗研究，得出汽爆玉米秸稈發酵丁醇的優化工藝，為進一步的放大試驗研究提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetbutylicum ZZU-01):鄭州大學生化中心保藏;種子培養基:5%玉米醪;種子液活化:取一玉米醪儲存的試管菌種，沸水浴中處理90 s.然后在厭氧操作臺上(YQX-Ⅱ厭氧培養箱，上海躍進醫療器械廠)接種于5%玉米醪培養基，活化至對數期;纖維素酶:濾紙酶活力110 IU/mL;汽爆玉米秸稈:將玉米秸稈切至3～4 cm長，于1.5 MPa，205℃條件下汽爆處理8 min，汽爆處理后秸稈經水洗脫毒并于80℃干燥恒重后，保藏待用;酶解液的制備:取一定量烘干的秸稈于錐形瓶中，加自來水，使底物質量分數為15%.然后按照糖化工藝設計的條件加入纖維素酶(30 IU/g)，木聚糖酶(200 IU/g)，Tween-20(質量分數為0.15%)，調pH為4.8，于50℃，150 r/min下反應一定時間后，離心取上清液.

1.2 糖化工藝設計

以蒸汽爆破預處理的玉米秸稈為原料，共進行了6種不同的秸稈糖化發酵丁醇工藝研究(稱為糖化工藝Ⅰ～Ⅵ).分別對比了汽爆玉米秸稈經6種糖化工藝后的丁醇發酵結果.不同糖化方法的具體工藝為

糖化工藝Ⅰ:將纖維素酶一次性加入，糖化48 h;

糖化工藝Ⅱ:首先加入纖維素酶量的1/2，反應24 h后再加入1/2纖維素酶，共糖化48 h;

糖化工藝Ⅲ:將纖維素酶分成3等份，首先加入纖維素酶量的1/3，每隔6 h加一次纖維素酶，共糖化24 h;

糖化工藝Ⅳ:纖維素酶加入法與糖化工藝Ⅲ相同，但糖化時間延至48 h;

糖化工藝Ⅴ:首先加入纖維素酶量的1/3，反應24 h后，再加入1/3纖維素酶，剩下的纖維素酶再隔12 h加入，共糖化48 h;

糖化工藝Ⅵ:初始底物體質量分數為15%，加入相應量的纖維素酶，反應24 h，每隔12 h，補一次原料，并且加入相應量的纖維素酶，共糖化48 h.

1.3 發酵培養基與培養方法

發酵培養基:秸稈酶解上清液1 L，酵母抽提物 1 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，(NH4)2SO45 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，尿素 2 g，CaCO35 g［3-4］.pH7.0，121 ℃，滅菌 20 min.除了考察培養基的影響因素外，其他試驗中的發酵培養基均采用以上基礎培養基.

發酵方法:將活化24 h的種子液，按體積分數為5%接種量進行接種，首先采用35℃，厭氧發酵72 h的條件，考察不同糖化工藝對丁醇發酵的影響.在此基礎上，對丁醇發酵的溫度、底物濃度、纖維素酶的用量、接種量和發酵時間進行了單因素試驗;對培養基酵母抽提物，KH2PO4，MgSO4·7H2O，(NH4)2SO4，FeSO4·7H2O，尿素和CaCO3進行了L32(74)正交試驗.在優化的基礎上，對發酵后的丁醇產量進行了考察.

1.4 分析方法

(1)秸稈成分測定:采用質量減重法［5］.

測得汽爆玉米秸稈主要成分為:纖維素的質量分數為33.68%;半纖維素的質量分數為7.29%;木質素的質量分數為22.31%.

(2)還原糖的測定:DNS 法［6］.

(3)溶劑的測定:氣相色譜法［7］.

2 試驗結果與分析

2.1 糖化工藝對丁醇發酵的影響

根據1.2節的試驗設計，以還原糖含量和發酵丁醇濃度為考察目標，試驗結果如表1所示.

表1結果表明，糖化工藝Ⅵ的還原糖含量最高，為48.77 g/L，但丁醇含量僅有4.01 g/L，這可能是因為分批補料糖化使底物濃度增加的同時，也增加了抑制劑的濃度，嚴重抑制了丁醇發酵.糖化工藝Ⅰ與Ⅱ相比較，可知分步酶解要比一步酶解得到的還原糖含量高，還原糖含量的增加，也使得后續的丁醇發酵的濃度升高.以上結果表明，多步糖化和適當的糖化時間能夠更充分地酶解纖維素，提高還原糖的含量，從而提高后續的丁醇發酵濃度.糖化工藝Ⅴ的丁醇產量達到了7.44 g/L，高于其它5種糖化發酵的丁醇產量，因此糖化工藝Ⅴ是汽爆玉米秸稈糖化發酵丁醇工藝中較優的工藝路線.下面在糖化工藝Ⅴ的基礎上，進一步優化丁醇發酵的工藝條件.

表1 不同糖化發酵試驗結果Tab.1 Fermentative results of different saccharification

2.2 丁醇發酵工藝條件的優化

2.2.1 溫度對發酵的影響

本研究以得到最高的丁醇濃度為考察目標，首先對溫度的影響進行考察.試驗條件為:底物濃度15%(質量分數)，纖維素酶用量30 IU/g，接種量7%，基礎培養基，發酵時間72 h.不同溫度對丁醇發酵的影響如圖1所示.由圖可知，本試驗中發酵溫度為37℃時，丁醇產量最高.

圖1 溫度對發酵的影響Fig.1 Effect of temperature on fermentation

2.2.2 底物濃度對發酵的影響

通常采用增加底物的方法，獲得較高的丁醇產量，提高丁醇生產的經濟性.但隨著底物的增加，會造成有害抑制物的積累等一系列問題［8］.因此尋找適宜的底物濃度顯得尤為必要.試驗對底物濃度研究條件如下:溫度37℃，纖維素酶用量30 IU/g，接種量7%，基礎培養基，發酵時間72 h.考察不同底物濃度對發酵的影響，結果如圖2所示.由圖可知，當底物質量分數為15%時，丁醇濃度最高.

圖2 底物濃度對發酵的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on fermentiaon

2.2.3 纖維素酶用量對發酵的影響

在丁醇發酵過程中，酶的水解對丁醇的生成有決定性的作用.在溫度37℃，底物濃度15%，接種量7%，基礎培養基，發酵時間72 h的試驗條件下，不同纖維素酶用量對發酵的影響如圖3所示.圖中結果表明，在纖維素酶用量25～40 IU/g的范圍內，丁醇濃度隨酶用量的增加而增加.較低的纖維素酶用量，不能有效的將秸稈酶解轉化為還原糖，不利于后續的發酵;而較高的纖維素酶用量會增加生產成本.因此，選用30 IU/g為較優的纖維素酶用量.

圖3 纖維素酶用量對發酵的影響Fig.3 Effect of loading of cellulose on fermentation

2.2.4 菌種接種量對發酵的影響

在發酵過程中，接種量與菌種的生長速度和丁醇的產量密切相關.因此，在溫度37℃、底物濃度15%、纖維素酶用量30 IU/g、基礎培養基、發酵時間72 h的試驗條件下，進一步考察接種量對發酵的影響，結果見圖4.接種量為7%時，丁醇產量最高.而接種量過高或過低，都會造成丁醇濃度明顯下降.所以確定7%為最佳接種量.

2.2.5 培養基組成對發酵的影響

發酵培養基的組成對菌體的生長代謝和溶劑的生成有重要的影響.因此筆者重點考察了酵母抽提物(A)，KH2PO4(B)，MgSO4·7H2O(C)，(NH4)2SO4(D)，FeSO4·7H2O(E)，尿素(F)和CaCO3(G)7種營養物組成對丁醇濃度的影響.試驗條件為:溫度37℃、底物濃度15%、纖維素酶用量30 IU/g、接種量7%、發酵時間72 h.試驗采用L32(74)正交試驗進行培養基的優化，優化試驗及結果見表2.

由表2的數據可以得到，優化培養基組成為:KH2PO40.8 g/L，MgSO4· 7H2O 0.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，尿素3 g/L，CaCO38 g/L.

進一步和丁醇濃度最高的28號試驗進行驗證試驗，結果如表3所示.

由表2和表3的結果，可得到較優的培養基組合為:酵母抽提物 1 g/L，KH2PO40.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，尿素2 g/L.在此條件下，發酵的丁醇濃度為9.37 g/L.

圖4 接種量對發酵的影響Fig.4 Effect of inoculums on fermentation

2.2.6 發酵時間對發酵的影響

發酵時間直接影響丁醇生產的效率.在溫度37℃，底物濃度15%，纖維素酶用量30 IU/g，接種量7%，優化的培養基的條件下，不同發酵時間對發酵的影響結果見圖5.

圖5 發酵時間對發酵的影響Fig.5 Effect of fermentation time on fermentation

表2 培養優化的正交試驗表Tab.2 Results of orthogonal experiment

試驗結果表明，當發酵時間達到48 h時，丁醇濃度已基本趨于平穩.因此，可以選擇48 h為較優的發酵時間，此時的丁醇含量為9.42 g/L.

表3 兩種培養基對發酵的影響Tab.3 Effects of two kinds of medium on fermentation

3 結論

(1)筆者通過對不同糖化發酵丁醇試驗結果的比較，得到糖化工藝Ⅴ，即首先加入纖維素酶量的1/3，反應24 h后，再加入1/3纖維素酶，剩下的纖維素酶再隔12 h加入，共糖化48 h是一條較佳的工藝路線.

(2)在糖化工藝Ⅴ的基礎上，通過對丁醇發酵工藝中8個影響因素的考察研究，得到了在溫度37℃，底物濃度15%，纖維素酶用量30 IU/g，接種量7%，優化的培養基組成:酵母抽提物1 g/L、KH2PO40.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，尿素2 g/L，發酵周期為48h的條件下，丁醇濃度達到9.42 g/L.

(3)試驗表明汽爆玉米秸稈糖化發酵丁醇，取得了較好的發酵效果，為進一步的放大試驗提供參考.

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