胎盤生長因子在寧心利肺湯干預肺動脈高壓動物模型中的作用

姜紅菊，張 偉，李潤智，陳守強，韓有為，王 營

1 材料與方法

1.1 動物模型建立與分組 30只Wistar雄性大鼠（體重200 g～220g），適應性喂養1周后，隨機選10只為正常組，另外20只按照60mg／kg野百合堿（將野百合堿溶于適量0.5mol／L的HCl中，用0.5mol／L的NaOH，將pH調整至7.4）項背部皮下注射。再隨機分為治療組及對照組，各10只，注射后第3天治療組給予寧心利肺湯灌胃（根據人每公斤體重劑量的6.25倍給予），每天1次，對照組給予同等量的生理鹽水灌胃，共6周。

1.2 壓力測定 動物飼養到規定的天數后，用戊巴比妥鈉35 mg／kg腹腔注射，麻醉充分后，取仰臥位，鈍性分離右側頸外靜脈，在上做一橫切口，將微導管（Finecross1.8F）插入，并經上腔靜脈、右心房、右心室到肺動脈，導管外端通過壓力換能器接電生理記錄儀，記錄肺動脈平均壓（MPAP）、右室收縮壓（RVSP）。

1.3 胎盤生長因子（PLGF）測定 壓力測定完后留取靜脈血0.5mL，離心留取血清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA檢測試劑盒）檢測胎盤生長因子的含量。

1.4 右心室肥厚指數測定 大鼠放血處死，解剖胸腔取出心臟，PBS緩沖液將心臟內血液沖洗干凈，沿房室溝剪去心房、主動脈和肺動脈，沿室間隔邊緣分離出右室，還有左室＋室間隔，用濾紙吸干水分后稱重并計算右室肥大指數＝右室／左室＋室間隔。

1.5 肺血管重構的觀察 取出心臟后，生理鹽水通過肺動脈沖洗剩余的血液，同時10%甲醛20cmH2O（1cmH2O＝0.098 kPa）壓力下經氣管注入肺中，約5min取出右肺，10%甲醛固定48h，常規石蠟包埋切片（在右中葉距肺門2mm～3mm處取材），行HE染色，應用圖像采集分析系統測量肺血管直徑＜300 μm管壁的相對中膜厚度（MT），計算MT%＝管壁的相對中膜厚度／外徑。

1.6 統計學處理 應用SPSS12.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析及q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組各檢測指標比較 實驗過程中，治療組大鼠死亡2只，對照組大鼠死亡1只。治療組和對照組大鼠體重無明顯差異。治療組大鼠右室收縮壓、肺動脈平均壓、胎盤生長因子、右室肥大指數、直徑＜300μm肺血管管壁中膜厚度及 MT%，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 3組各檢測指標比較（±s）

表1 3組各檢測指標比較（±s）

組別 n 體重（g） RVSP（mmHg） MPAP（mmHg）右室肥大指數（%） 管壁厚度（μm） MT（%） PLGF（ng／L）治療組 10 390.75±11.71 38.05±3.312） 27.11±1.382） 30.78±3.712） 32.17±6.642） 17.34±0.732） 3.72±0.712）對照組 10 378.24±10.751） 65.54±4.231） 38.67±1.851） 48.23±4.661） 47.63±9.891） 23.97±5.911） 5.15±0.371）正常組 10 384.65±12.43 24.73±6.52 14.78±1.93 25.91±0.77 11.68±1.24 6.59±1.63 2.33±0.47與正常組比較，1）P＜0.05；與對照組比較，2）P＜0.05

2.2 顯微鏡觀察 正常組肺血管管壁較薄、管腔內膜結構完整，無增生現象。對照組可見肺小動脈管壁明顯增厚、管腔縮小。治療組的變化較對照組明顯減輕。

3 討 論

肺動脈高壓主要原因是肺小動脈原發病變或其他的相關疾病導致的肺血管內皮、平滑肌細胞增生，肺血管閉塞，肺動脈阻力增加。它可引起右室后負荷增加、右室肥大、右心衰。目前肺動脈高壓動物模型的建立主要有慢性缺氧法、手術分流法、野百合堿注射法、肺葉切除＋野百合堿注射。本研究采用的是野百合堿注射。

野百合堿是雙吡咯類生物堿，在經過肺血管床時，損傷肺血管內皮細胞，引起平滑肌細胞增生，使血管屏障受損，誘發炎性細胞的浸潤及炎癥反應，增加縮血管物質內皮素、血栓素A2等，降低舒血管物質6－酮－前列腺素、降鈣素基因相關肽等，引起血管收縮，導致血管阻力增加、血管重構，這中間內皮細胞的損傷起了很重要的作用[1]。有很多實驗證實野百合堿可以重復誘導嚴重的進展型肺動脈高壓，本研究也給予了證實。本研究以大鼠為實驗對象，給予野百合堿注射，成功地誘導了肺動脈高壓大鼠模型，治療組、對照組注射野百合堿6周后肺動脈平均壓顯著高于正常組。可見野百合堿注射可以建立肺動脈高壓大鼠模型，以此模型為基礎進行的研究將對肺動脈高壓的臨床工作提供有意義的幫助。治療組、對照組右室收縮壓顯著高于正常組。肺動脈壓力升高可使右室后負荷加重，引起右心室的肥大，治療組、對照組的右室肥大指數也顯著高于正常組。Blaudszun等[2]將28只大鼠隨機分為兩組，一組注射野百合堿60mg／kg，4周后發現右室肥厚、收縮壓的升高及肺動脈高壓。同樣野百合堿成功誘導肺動脈高壓大鼠模型也見于Zapata－Sudo等[3]的報道。

本研究中野百合堿注射后大鼠直徑＜300μm肺血管管壁中膜厚度及管壁的相對中膜厚度占血管外徑的百分比都明顯高于正常大鼠，可見注射了野百合堿后大鼠的肺動脈發生了結構重構，出現了肺動脈的增生和肥厚。Zhao等[4]對豬腹腔注射野百合堿10mg／kg4個月～4.5個月，4周、8周后觀察到肺動脈高壓及其肺動脈的管壁中膜厚度的增加。提示野百合堿還可以成功建立豬的肺動脈高壓模型。

寧心利肺方由黃芪、麥冬、五味子、川芎、丹參、葶藶子、車前子、冬瓜皮、益母草、澤蘭、木香、生甘草組成。此方中黃芪健脾補虛，麥冬養陰生津，五味子斂陰益氣，3藥相合，使氣復津生，汗止陰存，氣充脈復。丹參、川芎活血化瘀使血行暢通，葶藶子、澤瀉、冬瓜皮泄肺利水，車前子、益母草活血利水。水在胸脅用葶藶子，因其素有“治肺經陽分氣閉”之功能，其“行氣祛瘀，瀉肺利水”效果顯著。補氣之中使用理氣之品木香，使全方補而不滯。炙甘草調和諸藥，從而達到氣復、血行水去，故不治痰而痰自去，不平喘而喘自平。本研究將它運用于肺動脈高壓大鼠，結果治療組右室收縮壓、肺動脈平均壓、胎盤生長因子、右室肥大指數、直徑＜300μm肺血管管壁中膜厚度及MT%較對照組明顯下降。可見此方對肺動脈高壓的有明顯療效。

胎盤生長因子屬于血管內皮生長因子家族，不僅控制血管生成，也精細調整炎癥反應。它能夠刺激肺血管平滑肌細胞核內皮細胞的增殖分化，引起血管的新生，加上它的促炎癥作用，引起血管重構[5]。本研究證實肺動脈高壓小鼠PLGF是增加的，也證實了它與肺動脈高壓存在相關性，并且寧心利肺湯治療后明顯下降，說明寧心利肺湯可以降低肺動脈高壓大鼠的肺動脈壓可能與對PLGF的影響有關。

[1]Tyler RC，Muramatsu M，Abman SH，etal.Variable expression of endothelial NO synthase in three forms of rat pulmary hypertension[J].Am J Physiol，1999，276（2pt 1）：297－303.

[2]Blaudszun GT，Morel DR.Superiority of desflurance over sevoflurance and isoflurane in the presence of pressure－overload right ventricle hapertrophy in rats[J].Anesthesiology，2012，117（5）：1051－1061.

[3]Zapata－Sudo G，Pontes LB，Silva JS，etal.Benzenesulfonamide attenuates onocrotaline－induced pulmonary arterial hypertension in a rat model[J].Eur J Phamacol，2012，690（1－3）：176－182.

[4]Zhao J，Liu R，Li H，etal.Pathological changes of monocrotalineinduced pulmary hypertension in miniature pigs[J].Journal of Southern Medical University，2012，32（6）：867－869.

[5]Tuder RM，Cool CD，Yeager M，etal.The pathobiology of pulmo nary hypertension endothetium[J].Clin Chest Med，2001，22：405－418.