同型半胱氨酸對高糖培養的人血管內皮細胞ICAM－1表達的影響

張卓偉，柳 潔，張華屏

糖尿病血管并發癥是糖尿病患者致死的主要原因之一，而內皮細胞的損傷是血管病變的前提。同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）作為心血管疾病的危險因素，與糖尿病血管并發癥的發生、發展有一定關系。但其具體發病機制尚未闡明。研究顯示可能與高血壓、血流流變學、血脂紊亂、高血糖等因素有關，而有關蛋白質、氨基酸代謝異常在糖尿病血管并發癥中作用的研究非常匱乏[1]。因此本研究觀察HCY對體外高糖培養的人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC）ECV－304活性氧的釋放和細胞間黏附分子－1（ICAM－1）mRNA表達的影響，為臨床早期干預高同型半胱氨酸血癥提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞株購自南京凱基生物合成有限公司；RPMI1640購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司。D－L同型半胱氨酸、胰蛋白酶為Sigma公司產品；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。PCR試劑盒購于大連寶生物公司，引物由上海生物公司合成。其他試劑均為國產分析純或進口分裝。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和實驗分組 人血管內皮細胞株用RPMI1640培養，用前加10%滅活胎牛血清。細胞置于5%的CO2培養箱中37℃孵育培養，0.25%的胰酶消化傳代。分組情況，正常對照組：含RPMI1640培養液。高糖組（HG組）：培養液中含終濃度25mmol／L葡萄糖。HCY組：培養液中含終濃度5 mmol／L HCY。高糖＋HCY組：培養液中含葡萄糖25mmol／L和 HCY 5mmol／L。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態

1.2.2.1 上清液收集及檢測 ECV－304以每孔1×106接種到6孔板上，當生長至85%融合時收集上清液。按上述實驗分組方法，在作用12h、24h、48h之后分別收集細胞培養上清液，離心以去除細胞碎片，－20℃保存備用，用硫代巴比妥酸法檢測MDA，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD。

1.2.2.2 RT－PCR檢測ICAM－1mRNA的表達水平 將ECV－304細胞接種于培養瓶中，隨機分組和處理同上。處理12 h、24h、48h后分別收集各組細胞，Trizol法提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的完整性。提取的RNA用紫外分光光度儀檢測260nm、280nm吸光度并求出A260／A280，結果是所提RNA值在1.8～2.0，說明純度符合要求。進行cDNA合成，反轉錄后的cDNA作為PCR模板。PCR擴增引物序列。ICAM－1 長 度 為 555bp，上游引物：5′－CAGTGACCATCTACAGCTTTCCGG－3′，下游引物：5′－GCTGCTACCACAGTGATGATGACAA－3′；內參照 GAPDH 上游引物：5′－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3′，下游引物：5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3′。PCR反應條件為：94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共進行35個循環。擴增完畢后取PCR產物10μL做1.5%的瓊脂凝膠電泳，凝膠圖像分析儀分析，根據目的基因與內參基因電泳條帶光密度的比值，進行ICAM－1mRNA表達水平的半定量分析。

1.3 統計學處理 每個實驗均重復3次，每次實驗至少有3個重復值。所有數據用SPSS13.0統計軟件進行處理，統計學分析用多因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 光鏡下細胞形態的觀察 正常人臍靜脈內皮細胞形狀為棱形，單層生長，呈典型的鵝卵石樣鑲嵌排列。5mmol／L HCY作用24h后，可見細胞普遍收縮，間隙增大，細胞變小變圓，并有片狀細胞脫失區。

2.2 細胞上清液中SOD活力的測定（見表1） HCY組、HG組、HG＋HCY組在各時間點SOD活力均低于正常對照組（P＜0.01），且HG＋HCY組較HG組、HCY組降低的更明顯（P＜0.01）。呈時間依賴性關系。

表1 ECV304細胞上清液SOD活力變化（±s） U／mL

表1 ECV304細胞上清液SOD活力變化（±s） U／mL

組別 n 12h 24h 48h正常對照組 3 24.602±0.446 24.026±0.197 24.038±0.066 HG組 3 22.584±1.3461） 20.145±2.4551） 16.872±1.6961）HCY組 3 21.216±2.3741） 18.665±1.3221） 14.047±6.7521）HG＋HCY組3 16.805±1.4411）2） 13.957±5.2241）2） 10.674±9.3981）2）與正常對照組相比，1）P＜0.01；與HG組HCY組相比，2）P＜0.01

2.3 細胞上清液 MDA水平的測定（見表2） HG組、HCY組、HG＋HCY組各時間點MDA水平均高于正常對照組（P＜0.01），且HG＋HCY組較HG組、HCY組升高的更明顯（P＜0.01）。隨時間延長，MDA水平逐漸升高（P＜0.01）。呈時間依賴性關系。

表2 ECV304細胞上清液MDA水平變化（±s） nmol／mL

表2 ECV304細胞上清液MDA水平變化（±s） nmol／mL

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2.4 測定ICAM－1mRNA 的表達（見圖1、表3） ICAM－1 mRNA擴增片段長度為555bp，GAPDH擴增片段長度為452bp，對照組ECV304ICAM－1mRNA呈低表達。HG組、HCY組、HG＋HCY組ICAM－1mRNA表達顯著高于同時間點對照組（P＜0.01），HG＋HCY組ICAM－1mRNA表達較HG組、HCY組增加的更明顯，具有時間依賴性。

表3 HCY對ECV－304細胞ICAM－1mRNA表達的影響（±s）

表3 HCY對ECV－304細胞ICAM－1mRNA表達的影響（±s）

組別 n 12h 24h 48h正常對照組 3 0.63±0.04 0.62±0.03 0.65±0.04 HG組 3 0.81±0.031） 0.92±0.011） 0.98±0.011）HCY組 3 0.90±0.021） 0.98±0.011） 1.07±0.021）HG＋HCY組 3 1.05±0.051）2） 1.19±0.041）2） 1.32±0.051）2）與正常對照組相比，1）P＜0.01；與HG組、HCY組相比，2）P＜0.01

圖1 HCY對血管內皮細胞ICAM－1mRNA表達的影響

3 討 論

同型半胱氨酸是一種血管損傷性氨基酸[2－4]，是蛋氨酸代謝的中間產物。它的生理作用是維持體內含硫氨基酸的平衡。目前研究表明糖尿病患者HCY水平的增高是血管病變的重要危險因素。高同型半胱氨酸血癥作為心血管疾病的獨立危險因素已經得到普遍認同，在最近的一項研究中發現，糖尿病與非糖尿病人群的比較，高同型半胱氨酸血癥是獨立于其他危險因素的與預期5年死亡率相關的危險因素，而且似乎是最強的危險因素[5]。大量研究發現[6]血漿同型半胱氨酸水平升高可加速動脈粥樣硬化，并出現動脈和靜脈血栓形成，從而引起心腦血管疾病及周圍血管疾病。

HCY致血管病變的機制不是十分清楚，國內外對大血管病變的研究認為，HCY的作用可能與血小板激活、平滑肌增生、內皮細胞功能失常、脂蛋白氧化和血黏滯度增加有關[7]。內皮損傷是導致糖尿病血管病變的重要因素。最近，有研究顯示HCY作用于培養的人血管內皮細胞，通過活性氧（ROS）的大量釋放，刺激NF－κB的活化，從而使ICAM－1mRNA的轉錄和表達上調及增強單核細胞的黏附和聚集[8]。適量的ROS是維持細胞正常生長和機體抗感染必需的，但過量的ROS可以對機體造成病理生理損害。另一項研究顯示，HCY可呈時間和劑量依賴性上調單核細胞對培養的人主動脈內皮細胞的黏附，0.1mmol／L HCY可使單核細胞的黏附增加5倍，同時血管細胞黏附分子－1（VCAM－1）mRNA的表達增加5倍[9]。為進一步探討高 HCY和高血糖兩種危險因子共存的致病危險性，本研究觀察高糖環境下HCY對血管內皮細胞的影響與ICAM－1表達的關系，結果顯示HCY組血管內皮細胞ICAM－1mRNA表達水平是增高的，而且HG＋HCY組較HCY組和HG組增高的更明顯，提示ICAM－1可能參與HCY對糖尿病血管病變的加重作用，同時HCY處理培養的血管內皮細胞，血紅素加氧酶和谷胱甘肽過氧化酶的表達和活性均減弱，提示HCY可抑制細胞抗氧化能力[10]。HCY也可通過抑制細胞抗氧化酶的活性[11]，減少活性氧的清除，導致活性氧在細胞內和線粒體內聚集[12]。活性氧又通過PKC及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）使轉錄因子NF－κB活化，啟動包括ICAM－1啟動子在內的多種細胞因子及生長因子的轉錄，從而導致一系列靶基因的表達，最終導致細胞功能的改變，這些細胞因子組成了復雜的網絡，作用于血管內皮細胞，促進血管病變的發生和發展。近年來有學者提出蛋白質同型半胱氨酸化（HcyT）在其致病中可能發揮重要作用[13]，而大量研究HcyT可能使血管內皮細胞呈劑量依賴性發生凋亡[14]。發現上述結論與本實驗研究結果一致，HG＋HCY組刺激能使內皮細胞發生氧化應激，使SOD下降，MDA升高，ICAM－1mRNA表達上調，且HG＋HCY組較HCY組和HG組改變的更顯著，并具有時間依賴性，提示HCY可能通過氧化應激機制上調ICAM－1的表達從而損傷血管內皮細胞。

黏附分子（adhesionmolecules）是由細胞產生、存在于細胞表面、介導細胞與細胞間或細胞與基質間相互接觸和結合的一類分子。黏附分子大多為糖蛋白，少數為糖脂，分布于細胞表面或細胞外基質中，以配體一受體相對應的形式發揮作用，導致細胞與細胞間、細胞與基質間或細胞－基質－細胞之間的黏附，參與細胞的信號轉導與活化、細胞的伸展和移動、細胞的生長及分化、炎癥、血栓形成、腫瘤轉移、創傷愈合等一系列重要生理和病理過程。ICAM－1是最重要的黏附分子之一，在體內分布較廣泛，主要分布在白細胞、內皮細胞和上皮細胞等表面，但在血管內皮細胞表達最強，在正常情況下僅有少量表達，但受缺氧、炎性細胞因子、內毒素等刺激后，內皮細胞ICAM－1表達增加，其增高是內皮細胞和白細胞損害與激活的標志[15]。

綜上所述，本實驗研究發現5mmol／L HCY刺激能使內皮細胞發生氧化應激，SOD下降，MDA升高，同時氧化應激又能引起ICAM－1的表達上調，產生大量的黏附分子，高表達的黏附分子通過增強血流細胞的黏附，造成相應微血管的阻塞和內皮細胞損傷，從而引起糖尿病血管病變的發生，近來大量臨床試驗證明HCY在患者體內的濃度高低可以反映其血管損傷的程度和心血管事件發生的概率高低[16]，此外還有大量研究發現任何導致血中葉酸、維生素B12或維生素B6濃度降低的營養缺乏均會增加高HCY，而適當補充維生素B族或葉酸可降低血漿中HCY水平。因此早期干預高同型半胱氨酸血癥對糖尿病患者具有重要意義。

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