辛伐他汀治療激素性股骨頭壞死患者的效果觀察及對循環內皮祖細胞功能的影響

張 輝 劉俊峰 黃軍華 張平方

華北油田總醫院骨科，河北任丘 062552

股骨頭壞死是骨科較為常見的一種疾病，發病機制較為復雜。在我國由于存在廣泛的糖皮質激素不合理應用，激素性股骨頭壞死的發病率尤為突出。有研究顯示，在長期大劑量激素的應用會造成股骨頭局部血管通透性改變以及血管活性物質異常分泌，進而引起血流減緩、血管內皮細胞損傷及微血栓形成，最終導致局部骨組織正常結構的破壞，并且其范圍和嚴重程度與血管內皮的損傷程度具有明顯的相關性[1]。而在維持血管內皮的正常結構和功能中也發揮著至關重要的作用的內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC），其數量和功能的下調參與了該疾病的進程。由于辛伐他汀能夠顯著改善EPC的功能狀態，本研究采用辛伐他汀對激素性股骨頭壞死患者進行治療，并對其循環EPC數量和功能進行了檢測，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇華北油田總醫院（以下簡稱“我院”）骨科2010年2月～2012年10月診治的激素性股骨頭壞死患者24例，隨機分為治療組及對照組，每組各12例。所有入選病例均符合股骨頭壞死診斷標準[2]。另選擇我院健康體檢者12例為正常組。各組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經我院倫理委員會審批通過，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

內皮細胞培養基EGM-2（瑞士Lonza公司）；FITC標記的血凝素（FITC-lectin，美國 Sigma公司）；DiI標記的乙酰化低密度脂蛋白 （DiI-acLDL，美國Molecular Probes公司）；噻唑藍（MTT，美國 Duchfo公司）；纖維連結蛋白（fibronectin，美國 Hematological Technologies公司）；淋巴細胞分離液（天津TBD公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 治療方法及療效評價 對照組患者予避免負重及相應的功能鍛煉，并以常規劑量規律的服用腸溶性阿司匹林和地巴唑。治療組患者在此基礎上予口服辛伐他汀（山東羅欣藥業股份有限公司，國藥準字H20065119）進行治療，0.01 g/d，連續應用12周。治療前后分別對兩組患者進行Harris評分以評價各組的臨床療效。

1.3.2 循環EPC體外培養及鑒定[3]所有患者治療前后于清晨空腹采集靜脈血20 mL，經過密度梯度離心分離收集單個核細胞。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌離心后，以EGM-2培養基重懸細胞并調整密度為1×107個/mL，將其接種至包被有纖連蛋白的24孔板中，于5%CO2、37℃培養箱內常規培養。第3天以PBS洗去未貼壁細胞，更換培養液繼續培養，并予隔日半量換液。第7天加入終濃度0.005 g/L的DiI-acLDL繼續培養4 h，2%多聚甲醛固定后，加入0.005 g/L的FITC-lectin于37℃孵育1 h，PBS洗滌后于熒光顯微鏡下進行觀察熒光表達情況，雙熒光陽性的細胞被認為是EPC。

1.3.3 細胞增殖能力檢測 細胞培養第7天時以0.25%胰蛋白酶消化細胞制備單細胞懸液并調整密度為1×105個/mL，加入 96 孔板中（0.2 mL/孔），在 5%CO2、37℃培養 92 h 后加入 5 g/L 四甲基偶氮唑鹽（MTT）（20 μL/孔）。培養 4 h 后吸棄培養基，并加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）振蕩溶解后用酶標儀檢測其570 nm處的吸光度（A值）。

1.3.4 黏附能力檢測 細胞培養第7天時以0.25%胰蛋白酶消化細胞制備單細胞懸液并調整密度為5×104個/mL，將其加入包被纖維連結蛋白的24孔板中（1 mL/孔），常規培養30 min后PBS沖洗3遍，200×相差顯微鏡下選取3個不同視野對貼壁細胞進行計數，取平均值。

1.3.5 細胞遷移能力檢測 細胞培養第7天時以0.25%胰蛋白酶消化細胞，用0.1%血清濃度、無細胞因子的EGM-2培養基調整密度為5×104個/mL，加入24孔板插入式培養皿（0.2 mL/孔），在24孔板中加入EGM-2完全培養基（0.6 mL/孔），并將插入式培養皿置于其中。常規培養24 h后取出培養皿去除內層細胞，1%多聚甲醛固定外層細胞并行結晶紫染色，200×相差顯微鏡下選取3個不同視野對細胞進行計數，取平均值。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 療效評價

治療前治療組 Harris評分為（76.32±3.97）分，對照組為（78.29±4.13）分，差異無統計學意義（t=0.263，P＞0.05）。經辛伐他汀治療 12周后，治療組 Harris評分[（93.47±4.06）分]較對照組[（87.63±3.59）分]有明顯的增高，差異有統計學意義（t=1.427，P＜0.05）。

2.2 EPC培養及鑒定

外周血單個核細胞體外培養7 d后可以呈短梭狀的細胞生成，具有典型EPC的形態特征，并且這些細胞同時具有攝取DiI-acLDL和結合FITC-lectin的能力，經Image J軟件進行圖像疊加后該類細胞呈現出雙陽性的黃色熒光（圖1）。

圖1 EPC的免疫熒光鑒定

2.3 EPC增殖能力的變化

MTT實驗顯示，正常組循環EPC在570 nm處的吸光度為（0.76±0.13），而治療組及對照組分別為（0.52±0.14）和（0.53±0.17），均低于正常組，差異均有高度統計學意義（t=5.73、4.95，均P＜0.01），且治療組與對照組之間差異無統計學意義（t=0.34，P＞0.05）。在治療12周后，治療組患者EPC的體外增殖能力顯示，其在570 nm處的吸光度為（0.72±0.15），明顯高于對照組（0.62±0.11），二者差異有高度統計學意義（t=4.76，P＜0.01）。

2.4 EPC黏附能力的變化

正常組EPC在體外培養30 min后的貼壁細胞數為（13.42±3.15）個/HPF，而治療組與對照組分別為（5.93±1.67）個/HPF 和（5.67±1.58）個/HPF，均少于正常組，差異均有統計學意義（t=4.68、4.37，均 P＜0.01），且治療組與對照組之間差異無統計學意義 （t=0.24，P＞0.05）。在治療12周后，治療組患者EPC的體外黏附能力顯示，其貼壁細胞數為（11.93±3.45）個/HPF，明顯多于對照組[（8.51±3.63）個/HPF]，差異有高度統計學意義（t=3.26，P＜0.01）。

2.5 EPC遷移能力的變化

正常組EPC在24孔插入式培養皿內培養24 h后，遷移至皿外層的細胞數量為（13.62±3.73）個/HPF，而治療組與對照組分別為（6.28±1.53）個/HPF 和（6.64±1.75）個/HPF，均少于正常組，差異均有高度統計學意義（t=4.32、4.66，均P＜0.01），且治療組與對照組之間差異無統計學意義（t=0.22，P＞0.05）。在治療12周后，治療組患者EPC的體外遷移能力顯示，其遷移至皿外側的細胞數為 （10.56±3.09）個/HPF，明顯多于對照組[（7.48±3.13）個/HPF]，差異有高度統計學意義（t=3.37，P＜0.01）。

3 討論

盡管糖皮質激素的應用可以引起骨質疏松的發生已經得到廣泛的認可，然而對于激素性股骨頭壞死的發病機制卻尚無定論。近年來，有研究顯示，股骨頭局部毛細血管密度的增加可以顯著的降低股骨頭缺血性壞死的發生[4]，由此有學者認為，血管性因素有可能在股骨頭壞死的病理生理機制中起到了關鍵性的作用[5]。作為血管內皮細胞前體的EPC主要定居于骨髓，僅有極少量存在于外周血中，它不僅參與了血管生成及再生，同時在特定的狀態下，可以遷移并歸巢至發生損傷的血管部位，在血管損傷后的修復中發揮著至關重要的作用[6]，其數量及功能的變化對于血管相關性疾病的評估亦具有一定的價值。

相關的研究顯示，在激素的長期使用可以在體內通過多種途徑對EPC的數量和功能產生影響[7]。一方面激素可以對血管內皮產生的直接損傷作用，導致內皮細胞的損傷和凋亡，另一方面激素的使用可以顯著降低體內一氧化氮及血管內皮生長因子等血管活性物質合成，進而使EPC的增殖、遷移能力和血管生成能力減低[8-9]。諸多方面因素共同作用的結果將有可能導致在激素長期應用過程中循環EPC數量和功能的改變，進而造成股骨頭局部由于血管數量及功能的異常而發生骨細胞的營養狀態受到抑制而產生凋亡甚至壞死。本研究對激素性股骨頭壞死患者的循環EPC包括增殖、黏附、遷移能力在內的各項功能指標進行了檢測。結果顯示與正常人群相比，激素性股骨頭壞死患者循環EPC的體外功能指標存在不同程度的下調。由此推測，在激素長期大量應用的過程中，由于其對血管內皮細胞的損害導致股骨頭局部微血管內皮細胞的壞死脫落，而在血管損傷修復中起到關鍵性作用的EPC由于多種細胞因子的分泌受到抑制而使其數量減少，且嚴重影響了其功能的有效發揮，最終使得受損的血管內皮不能得到及時有效的修復而發生舒張功能受損，甚而造成局部微血栓的形成及血管的閉塞，從而影響股骨頭局部的正常血液供應而導致骨質的廣泛性破壞和結構的改變。

辛伐他汀具有調節內皮細胞功能、抑制平滑肌細胞增殖、抗炎、抗氧化等非調脂作用，作為臨床廣泛應用的高效降脂藥物廣泛地應用于多種心血管疾病。同時近年來其特有的改善EPC功能的作用也越來越受到人們的廣泛關注，研究顯示，他汀類藥物能夠促進EPC的動員、遷移及分化，有利于改善EPC的功能，促進缺血區域的血管新生[10]。并且其對激素性股骨頭壞死的臨床療效亦有報道[11]。在本研究中，利用辛伐他汀對激素性股骨頭壞死患者進行了治療，結果顯示，辛伐他汀的確對于激素性股骨頭壞死患者的臨床癥狀改善有所幫助，治療組在應用辛伐他汀12周后其循環EPC的各項體外功能指標均較對照組存在明顯上調，與之相應的Harris評分也較對照組有顯著的提高。這表明辛伐他汀能夠通過改善激素性股骨頭壞死患者循環EPC的功能，發揮其對股骨頭局部微血管的修復功能，有效地改善股骨頭的局部血液供應，從而達到對股骨頭壞死的治療作用。

[1]Seguln C，Kassis J，Busque L，et al.Non-traumatic necrosis of bone（osteonecrosis）is associated with endothelial cell activation but not thmmbophilia[J].Rheumatology（Oxford），2008，47（8）：115l-1155.

[2]ARCO （Association Research Circulation Osseous）.Committeeon Terminology and Classification[J].ARCO News，1992，（4）：41-46.

[3]Liu JF，Du ZD，Chen Z，et al.Endothelial progenitor cell downregulation in a mouse model of Kawasaki disease [J].Chin Med J，2012，125（3）：496-501.

[4]Wu X，Yang S，Duan D，et al.A combination of granulocyte colony stimulating factor and stem cell factor ameliorates stemid-associated osteonecresis in rabbits[J].J Rheumatol，2008，35（9）：224l-2248.

[5]Kerachian MA，Harvey EJ，Coumoyer D，et al.A vascular necrosis of the femorat head：vascular hypotheses [J].Endothelium， 2006，13（8）：237-244.

[6]Werner N，Kosiol S，Schiegl T，et al.Circulating endothelial progenitor cells and cardiovascular outcomes [J].N Engl J Med，2005，353（24）：999-1007.

[7]Vogt CJ，Sehmid-Sehonbein GW.Microvascular endothelial cell death and rarefaction in the glucacorticoid-induced hypertensive rat[J].Microcirculation，2001，8（4）：129-139.

[8]Li X，Jin L，Cui Q，et al.Steroid effects on osteogenesis through mesenchymal cell gene expression[J].Osteoporos Int，2005，16（3）：101-108.

[9]Akaike M，Matsumoto T.Glucocorticoid-induced reduction in NO bioavailability and vascular endothelial dysfunction[J].Clin Calcium，2007，17（8）：864-870.

[10]Deschaseaux F，Selmani Z，Falcoz PE，et al.Two types of circulating endathelial progenitor cells in patients receiving long term therapy by HMG-CoA reductase inhibitors[J].Eur J Pharmacol，2007，562（1-2）：111-118.

[11]劉會怡，潘昌如，潘平.辛伐他汀治療早期激素引起缺血性股骨頭壞死[J].中國中西醫結合外科雜志，2012，18（2）：178-180.