苯并芘氧化損傷鼠肺泡細胞及維生素E對其保護作用的機制研究

初巍巍，霍 陽，陳 悅，宋 濤，趙躍萍，王 莉

苯并芘(Benzo-a-pyrene，BaP)是典型的多環芳烴類化合物(PAHs)，主要來源于能源物質的不完全燃燒，是環境污染物。BaP誘導細胞凋亡的途徑很多，研究最多的是氧化應激反應，Billet等［1］研究證明BaP經胃腸道吸收進入血液，在體內轉換為羥基化合物或醌類［2］，肝臟代謝過程中產生二氫二醇環氧苯并芘(BaP-7，8-Dihydrodiol-9，10-Epoxide，BPDE)來降低毒性，但代謝過程中產生大量活性氧(ROS)，導致超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性改變，造成細胞氧化損傷壞死［3］。

維生素E作為人體重要營養素，在抗氧化與調節女性內分泌方面起著重要的作用［4］，研究證明維生素E可以有效捕捉、清除超氧陰離子自由基、單線態氧和過氧化氫等，阻斷或防止自由基引發的氧化反應，以防止過氧化反應加劇，保護生物膜免受氧化和過氧化損傷，參與調節抗自由基反應的抗氧化酶活性，增加機體對自由基的清除能力，是已被確認的自由基清除劑［5］。而維生素E能否抑制BaP所導致的肺泡細胞氧化損傷，值得我們去深入探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:100只ICR雄性小鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號SCXK-(京)2007-0001，6～8周齡，體重28～32 g。

1.1.2 主要試劑:維生素E、BaP為sigma公司產品;GSH-PX活性檢測、SOD活性檢測、丙二醛(MDA)含量檢測、ROS活性檢測試劑盒均為南京建成生物科技公司產品。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的分組與處理:將100只小鼠隨機分為A、B、C、D、E 5組，每組 20只，人工控溫 20～26℃，12 h光照，12 h黑暗，顆粒飼料喂養，自由飲水取食。A組:BaP 2 mg/(kg·d);B組:維生素E 10 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);C 組:維生素E 20 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);D 組:維生素 E 40 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);E 組:相同體積的橄欖油。BaP與維生素E均用橄欖油配成混懸液，配好后避光4℃保存，現用現配。連續灌胃15 d，最后一次灌胃后用頸椎脫臼法將小鼠處死并放于冰臺上，無菌條件下取出肺組織，HE染色制作成切片后觀察，可見A、B、C、D組給予BaP后肺泡細胞核呈現棕黃色，固縮，并出現核碎裂，形成凋亡小體，表明肺泡細胞發生凋亡。

1.2.2 實驗方法:1周內將取出的肺組織用勻漿機10 000～15 000 r/min的轉速研磨，每次10 s，間隔30 s，連續3～4次，溫度4℃，按試劑盒說明測定GSH-PX、SOD與ROS活性并檢測MDA含量。

1.3 統計學分析 采用SPSS 10.0軟件進行統計學分析，計量資料結果以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用方差分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 GSH-PX活性 A組肺泡組織中GSH-PX的活性明顯低于B、C、D、E 組(P ＜0.05)，B、C、D 組肺泡組織中GSH-PX的活性隨著維生素E劑量的增加活性逐漸增強，且3組間活性均有統計學差異(P＜0.05)，B、C、D組血清中GSH-PX的活性均低于 E組(P＜0.05)，結果見表1。

2.2 SOD活性 A組肺泡組織中SOD活性明顯低于 B、C、D、E 組(P ＜0.05)，B、C、D 組肺泡組織中SOD活性隨著維生素E劑量的增加逐漸增強，但C、D兩組間無統計學差異(P＞0.05)，B、C、D 組血清中SOD活性均低于E組(P＜0.05)，結果見表1。

表1 5組鼠肺泡細胞中GSH-PX、SOD活性比較(±s)

表1 5組鼠肺泡細胞中GSH-PX、SOD活性比較(±s)

注:GSH-PX:谷胱甘肽過氧化物酶，SOD:超氧化物歧化酶。A組:苯并芘(BaP)2 mg/(kg·d);B組:維生素 E 10 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);C組:維生素E 20 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);D 組:維生素 E 40 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);E組:相同體積的橄欖油。與E組比較，aP＜0.05;與 A組比較，cP＜0.05;與 B組比較，eP＜0.05;與C組比較，gP＜0.05

組別 鼠數 GSH-PX(μmol/L) SOD(U/ml)20 24.547 ±0.436 242.41 ±8.42 A 組 20 17.231 ±0.452a 184.32 ±8.31a B 組 20 18.382 ±0.433ac 199.52 ±13.21ac C 組 20 21.834 ±0.329ace 221.31 ±9.32ace D 組 20 22.481 ±0.325aceg 224.42 ±10.31 E組ace

2.3 ROS活性 A組肺泡組織中ROS的活性明顯低于B、C、D 組(P＜0.05)，高于 E組(P＜0.05)，B、C、D組肺泡組織中ROS的活性隨著維生素E劑量的增加逐漸增強，但B、C兩組間無統計學差異(P ＞0.05)，B、C、D 組肺泡組織中 ROS的活性均高于E組(P＜0.05)，結果見表2。

2.4 MDA濃度 A組肺泡組織中MDA濃度明顯高于B、C、D、E 組(P ＜0.05)，B、C、D 組肺泡組織中MDA的活性隨著維生素E劑量的增加濃度逐漸降低(P＜0.05)，B、C組肺泡組織中MDA濃度均低于E組(P＜0.05)，但D、E兩組間無統計學差異(P＞0.05)，結果見表 2。

表2 5組鼠肺泡細胞中ROS活性、MDA含量比較(±s)

表2 5組鼠肺泡細胞中ROS活性、MDA含量比較(±s)

注:ROS:活性氧，MDA:丙二醛。A組:苯并芘(BaP)2 mg/(kg·d);B組:維生素E 10 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);C 組:維生素 E 20 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);D組:維生素E 40 mg/(kg·d)+BaP 2 mg/(kg·d);E組:相同體積的橄欖油。與E組比較，aP＜0.05;與A組比較，cP＜0.05;與B組比較，eP＜0.05;與C組比較，gP＜0.05

組別 鼠數 ROS(U/ml) MDA(nmol/ml)20 573.43 ±28.43 58.75 ±3.31 A 組 20 785.31 ±23.21a 79.32 ±5.42a B 組 20 792.21 ±12.22ac 71.21 ±3.42ac C 組 20 794.56 ±10.31ac 62.21 ±7.52ace D 組 20 945.32 ±32.21aceg 58.43 ±8.42 E組ceg

3 討論

BaP作為多環芳烴類物質的代表，廣泛存在于煙囪、煤焦油、燃燒煙草的煙霧和內燃機尾氣以及烹飪油煙和熏炸食物中，為淡黃色長針狀結晶體，分子式為C20H12，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于苯、乙醚、丙酮、DMSO等有機溶劑，具有高脂溶性和較強的氧化活性，可導致細胞氧化損傷而造成染色體畸形［6］。維生素E分子式為C31H52O3，天然維生素E為淡黃色油狀液體，容易在堿性或酸性物質中變性，暴露于空氣中易被氧化，在無水乙醇、丙酮、植物油中易溶解，其抗氧化活性已得到證實。補充維生素E能減少BaP誘導的DNA氧化損傷，改善細胞功能，而且體內實驗發現維生素E(100～3200 IU/d)沒有明顯的致癌或致突變性［7］。

GSH-PX是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它特異性催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的還原反應。GSH與超氧陰離子自由基(O2－)反應可產生O2，GSH-PX對其他抗氧化劑具有調節作用［3］。SOD是一種帶負電荷的金屬蛋白酶，能催化超氧陰離子發生歧化反應，從而阻斷和防止超氧陰離子所引發的一系列自由基連鎖反應的加劇［8］。因此兩酶的活性反映了組織的抗氧化能力。本實驗結果顯示給予BaP灌胃后，其肺泡組織GSH-PX、SOD活性降低，進一步說明BaP能降低機體抗氧化能力，而給予維生素E對抗后兩酶的活性明顯升高，說明抗氧化劑能提高機體抗氧化能力并能很好地清除肺泡組織中的氧化應激物質。

自由基是指能夠獨立存在、含有未成對電子的原子、原子團、分子或離子，其中ROS是一種重要的自由基。在正常條件下體內會產生少量自由基，并且有一定的功能，且受控的自由基對人體有利［9］。機體內存在著一整套完整的清除自由基的防御系統，抗氧化酶是其中之一。過多自由基的產生，超出了防御能力，就會對機體產生有害作用。膜脂過氧化物產物MDA的含量增加可以直接反映自由基生成增多。從小鼠肺泡組織的氧化－抗氧化指標檢測結果可以看出，BaP處理不但沒有降低肺泡組織中ROS活性，反而增加其活性，且GSH-PX與SOD活性均降低，維生素E干預后，ROS活性不但沒有減少，反而增加，說明BaP與維生素E聯合作用時，維生素E可能不表現其抗氧化作用，反而表現一定的氧化作用，與楊杰等［10］的結論相同。此外Schneider等［11］認為，我們所理解的維生素E在人類營養、保健和疾病中所起的作用在過去20多年中已發生了轉變，它既是一種抗氧化劑，還有促氧化劑的功能，甚至有非氧化劑的功能。而MDA的含量在給予BaP處理的小鼠肺泡組織中含量升高，經維生素E對抗后濃度降低，與楊杰等［10］的結論相同。

本實驗進一步證實了BaP導致體內氧化應激狀態改變，降低體內抗氧化酶活性并且升高了氧化物質的含量，而口服一定量的維生素E能降低其濃度并很好地提升抗氧化酶活力，而維生素E并不能降低ROS的活性，反而使其活性升高，其具體機理還有待進一步研究。維生素E這種安全可靠的保健藥物的使用為今后大城市中預防空氣污染物，特別對于糾正空氣污染物中的氧化物質對人體氧化應激狀態與免疫因子失衡有著很好的指導意義。

［1］Billet S，Abbas I，Goff J L，et al.Genotoxic potential of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons-coated onto airborne Particulate Matter(PM 2.5)in human lung epithelial A549 cells［J］.Cancer Lett，2008，270(1):144-155.

［2］胡望均.常見有毒化學物品環境事故應急處理技術與監測方法［M］.北京:中國環境科學出版社，1993.

［3］Woo H D，Kim B M，Kim Y J，et al.Quercetin prevents necrotic cell death induced by co-exposure to benzo(a)pyrene and UVA radiation［J］.Toxicol In Vitro，2008，22(8):1840-1845.

［4］Avila-Ramos F，Pro-Martínez A.Dietary supplemented and meat-added antioxidants effect on the lipid oxidative stability of refrigerated and frozen cooked chicken meat［J］.Poult Sci，2013，92(1):243-249.

［5］Ohta Y，Yashiro K，Ohashi K，et al.Vitamin e depletion enhances liver oxidative damage in rats with water-immersion restraint stress［J］.J Nutr Sci Vitaminol(Tokyo)，2013，59(2):79-86.

［6］Gu B W，Bessler M，Mason P J.A pathogenic dyskerin mutation impairs proliferation and activates a DNA damage response independent of telomere length in mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(29):10173-10178.

［7］李世健，王明，張龍，等.比較褪黑素與維生素E在對抗早期糖尿病大鼠膀胱氧化性損傷的作用［J］.重慶醫科大學學報，2013，38(2):143-147.

［8］Raunig J M，Yamauchi Y，Ward M A，et al.Placental inflammation and oxidative stress in the mouse model of assisted reproduction［J］.Placenta，2011，32(11):852-858.

［9］Rizzo A，Roscino M T，Binetti F，et al.Roles of reactive oxygen species in female reproduction［J］.Reprod Domest Anim，2012，47(2):344-352.

［10］楊杰，鄭宇飛，陳照立，等.維生素E對苯并(a)芘所致小鼠肺癌的干預作用［J］.環境與健康雜志，2008，25(1):21-24.

［11］Bhatti F U，Mehmood A，Wajid N，et al.Vitamin E protects chondrocytes against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in vitro［J］.Inflamm Res，2013，62(8):781-789.