梯度洗脫高效液相色譜法測定辛伐他汀分散片的含量和有關物質

付莉娜 ，鄭金琪 ，鄭國鋼 ，陶巧鳳 ，

(1.浙江工業大學藥學院，浙江 杭州 310014;2.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310004)

辛伐他汀為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶抑制劑[1]，可阻斷膽固醇的生物合成[2]，對高膽固醇血癥、混合型高脂血癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和腦中風的防治等有明顯的療效[3－4]，是一種高效的調血脂藥。辛伐他汀分散片可在水中迅速崩解成均勻的混懸液，具有服用方便、吸收快、生物利用度高等特性[5]。但辛伐他汀分子結構中含有不穩定基團4－羥基－2H－6氧合－吡喃環，容易被氧化[6]，在生產和貯藏過程中亦可能產生降解物，因而一般在制劑處方中加入抗氧化劑(常用的是叔丁基－4－羥基－茴香醚和抗壞血酸)，以增加辛伐他汀的穩定性。經查閱，其國家藥品標準中未進行有關物質檢查[7]。筆者參考文獻[8]和2010年版《中國藥典(二部)》[9]辛伐他汀片的質量標準，經方法學研究，建立了測定辛伐他汀分散片含量和有關物質的梯度洗脫高效液相色譜(HPLC)法。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀(2695泵，2996二極管陣列紫外檢測器);Empower色譜工作站;Mettler AE 240型電子天平。洛伐他汀對照品(批號為100600－200301)和辛伐他汀對照品(批號為100601－200502)由中國食品藥品檢定研究院提供;辛伐他汀銨(分析純，浙江江北藥業有限公司);辛伐他汀分散片(規格為每片10mg，批號為3134825;規格為每片20mg，批號為3134839;規格為每片40mg，批號為3134830)為廣州南新制藥有限公司產品;乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Supelco C18柱(33mm×4.6mm，3μm);流動相:A 為乙腈－0.1%磷酸溶液(50∶50)，B為含0.1%磷酸乙腈溶液，梯度洗脫程序見表1;流速:3.0mL/min;檢測波長:238 nm。取辛伐他汀對照品約20mg，置50mL容量瓶中，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液－乙腈(1∶1)的混合溶液5.0mL，振搖使溶解，放置5min，加稀鹽酸中和后用2.2項下溶劑稀釋至刻度，得含開環降解物辛伐他汀酸的溶液，取5.0mL以及洛伐他汀與辛伐他汀對照品各約2mg，置同一100mL容量瓶中，加2.2項下溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統適用性試驗溶液。取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果辛伐他汀酸峰與洛伐他汀峰的分離度應大于4.0，理論板數按辛伐他汀峰計算不低于2 000。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

有關物質:取本品細粉適量(約相當于辛伐他汀80mg)，精密稱定，置100mL容量瓶中，加溶劑[0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調節pH至4.0)－乙腈(40∶60)]溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液;精密量取1.0mL，置100mL容量瓶中，加上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

含量測定:稱取辛伐他汀對照品約10mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加上述溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液;取本品細粉適量(約相當于辛伐他汀10 mg)，精密稱定，置100mL容量瓶中，加上述溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 有關物質

專屬性試驗:取依處方比例混合的輔料適量，依2.2有關物質項下方法制備成輔料溶液，分別取2.2項下溶劑、輔料溶液、系統適用性溶液各10μL進樣。結果見圖1。可見，溶劑對測定無干擾，輔料出峰時間在0.6min以內，在相對主峰保留時間的0.3倍內;辛伐他汀酸、洛伐他汀和辛伐他汀的出峰時間分別為1.256，1.473，2.135min，辛伐他汀酸峰與洛伐他汀峰之間的分離度為1.6，洛伐他汀峰與辛伐他汀峰之間的分離度大于5.0。

圖1 高效液相色譜圖

強制破壞試驗:取批號為3134830的樣品粉末5份，每份約含辛伐他汀40mg，分別置50mL量瓶中，加2.2項下溶劑10mL，振搖使辛伐他汀溶解。分別加入1.0mol/L鹽酸溶液5.0mL，放置24 h，加 1.0 mol/L 氫氧化鈉溶液 5.0mL 中和后，加 2.2項下溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為酸破壞供試品溶液;加入 1.0mol/L 氫氧化鈉溶液 5.0mL，放置 24 h，加 1.0mol/L 鹽酸溶液5.0 mL中和后，加2.2項下溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為堿破壞供試品溶液;加入10%過氧化氫溶液5.0mL，放置 24 h，加 2.2 項下溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為氧化破壞供試品溶液;在(4 500±500)lx光照強度下放置24 h，加2.2項下溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為光照破壞供試品溶液;在60℃水浴中加熱6 h，放冷，加2.2項下溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為熱破壞供試品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，結果見圖2。可見，辛伐他汀主峰與強制破壞降解產物均能獲得很好的分離。

圖2 強制破壞試驗高效液相色譜圖

相對響應因子測定:洛伐他汀是合成辛伐他汀的起始物料，辛伐他汀酸是辛伐他汀的降解產物。辛伐他汀酸極不穩定物質，故使用其穩定的銨鹽辛伐他汀銨進行試驗。結果洛伐他汀與辛伐他汀的相對響應因子為1.02，辛伐他汀酸與辛伐他汀的相對響應因子為 0.92。

檢測限測定:取含辛伐他汀、洛伐他汀與辛伐他汀酸的對照品溶液，逐步稀釋，測得辛伐他汀、洛伐他汀與辛伐他汀酸的檢測限分別為 25.14 ng/mL(S/N≈4.6)，20.04 ng/mL(S/N≈2.7)和 27.16 ng/mL(S/N≈3.9)。

穩定性試驗:取批號為3134825的供試品溶液，分別于0，1，3，6，12 h時進樣，測定有關物質。結果見表2。可見，供試品溶液在12 h內有關物質有所增加，但在6 h內基本穩定，故建議在供試品溶液制備3 h內測定。

表2 有關物質測定溶液穩定性試驗結果

2.3.2 含量測定

線性關系考察:取辛伐他汀對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加2.2項下溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標準貯備液;精密量取 0.2，0.5，0.8，1.0，1.2，1.5，1.8mL，分別置10mL容量瓶中，用2.2項下溶劑稀釋至刻度，搖勻，取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以質量濃度 C(μg/mL)對峰面積A作標準曲線，線性回歸方程為 A=12 493C+2 199，r=0.999 9(n=7)。結果表明，辛伐他汀質量濃度在 20.02～180.2 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

精密度試驗:取批號為3134825的樣品，于同一日內及不同日內依法分別連續測定含量6次，得日內和日間精密度。結果辛伐他汀的含量為 93.5% 和 93.8% ，RSD 為 0.59% 和 0.69%(n=6)，表明方法精密度良好。

回收率試驗:取處方量輔料，另取辛伐他汀對照品適量，按2.2項下方法分別制備成高、中、低3種不同質量濃度的溶液(120%，100%，80%)各3份，分別取上述溶液各10μL，注入液相色譜儀，以外標法測定含量并計算回收率。結果平均回收率為99.9% ，RSD 為 0.51%(n=9)。

2.4 樣品測定

有關物質:取樣品3批，按2.2項下方法分別制備成供試品溶液和對照溶液。精密量取對照溶液10μL注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%;再精密量取供試品溶液和對照溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如顯雜質峰，扣除相對主峰保留時間0.3倍內的輔料峰，單個雜質峰面積不得大于對照溶液的主峰面積(1.0%)，各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的3倍(3.0%)，供試品溶液中任何小于對照溶液主峰面積0.05倍的峰可忽略不計。結果見表3。

含量測定:取樣品3批，按2.2項下方法分別制備成對照品溶液和供試品溶液。精密量取10μL注入液相色譜儀，按外標對照品法測定含量。結果見表3。

3 討論

辛伐他汀含六元內酯環等不穩定基團，易被氧化和水解，在生產和貯藏過程中亦可能產生降解產物，而現行國家藥品標準中未進行有關物質檢查。本試驗中參考2010年版《中國藥典(二部)》辛伐他汀片標準，對3批樣品進行了有關物質檢查，結果單個雜質 0.20% ～0.33%，雜質總量 0.64% ～0.77%，故有必要對其有關物質進行控制。辛伐他汀是不穩定物質，對酸、堿、熱和氧化均不穩定，市售辛伐他汀分散片的有效期為2年，考慮到產品在有效期內的降解空間，建議限度訂為單個雜質不得過1.0%，雜質總量不得過3.0%。

由試驗結果可知，洛伐他汀、辛伐他汀酸與辛伐他汀的相對響應因子在0.90～1.10范圍內，為方便試驗，采用以洛伐他汀和辛伐他汀酸外標定位(系統適用性試驗)，以辛伐他汀為自身對照測定有關物質。

廠家在辛伐他汀分散片處方中加入了抗氧化劑以增加穩定性，抗氧化劑的保留時間在相對主峰保留時間0.3倍內;同時，對辛伐他汀原料藥亦進行了降解試驗，結果在相對主峰保留時間0.3倍內基本無降解雜質峰。因此，擬在有關物質測定時，扣除相對主峰保留時間0.3倍內的輔料峰后，測定辛伐他汀分散片的最大單個雜質和雜質總量。

表3 樣品有關物質及含量測定結果

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