阿維A對硬皮病小鼠的治療作用及機制研究

沈佚葳 王 京 周 平▲

1.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院皮膚科，北京 100038；2.首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院中心實驗室，北京 100038

系統(tǒng)性硬皮病（systemic sclerosis，SSc）是一種以皮膚及內臟器官纖維化或硬化，最后發(fā)展至萎縮為特點的結締組織病[1]。在我國結締組織病中硬皮病的發(fā)病率高，病因及發(fā)病機制復雜，治療手段有效。維A酸類藥物在表皮分化、真皮重建及皮膚炎癥中發(fā)揮重要作用，臨床上主要用于治療銀屑病、痤瘡及角化過度性皮膚病。近年來，維A酸的抗纖維化作用逐漸得到認識，文獻報道阿維A可緩解硬皮病患者皮膚硬化，且對皮膚硬化為主的移植物抗宿主病（GVHD）有效[2-3]。本試驗利用博來霉素構建小鼠硬皮病模型，觀察阿維A對皮膚和肺部纖維化的治療作用。

輔助T細胞17（Th17）是一種新的T細胞亞群，主要分泌白介素（IL）-17和IL-6，其在自身免疫病和過敏性疾病中發(fā)揮重要的免疫調節(jié)作用。調節(jié)性T細胞 （Treg）與Thl7細胞均來源于共同的前體細胞CD4+T細胞，兩者關系密切，Treg細胞主要分泌轉化生長因子 （TGF）-β和IL-10，在免疫耐受的誘導中發(fā)揮重要作用，抑制自身免疫性疾病的發(fā)生[4]。文獻報道硬皮病患者存在外周血Th17/Treg細胞體系失衡，本研究通過檢測小鼠外周血Th17/Treg相關因子 IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1，探討阿維 A 治療硬皮病可能的機制，為硬皮病的發(fā)病機制及治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡雌性SPF BALB／c小鼠，體重16～20 g，共24只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)于北京大學實驗動物中心，置于清潔級環(huán)境，普通飼料和水飼養(yǎng)。

1.1.2 主要實驗試劑 注射用鹽酸博來霉素（BLM），15 mg/支，產自日本化藥株式會社。阿維A膠囊，10 mg/粒，產自重慶華邦制藥公司。小鼠 IL-17、IL-10、IL-6、TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、模型的建立及給藥方法 24只小鼠隨機分為對照組、硬皮病組和阿維A組，每組8只。實驗前用脫毛膏將背部毛發(fā)去除，標記出一個1 cm×1 cm大小的注射區(qū)。參照文獻[5]建立SSc動物模型:對照組以酸鹽緩沖液（PBS）皮下注射，每次0.1 mL，每日1次，共4周；硬皮病組和阿維A組以300 μg／mL濃度的博萊霉素液皮下注射，每次0.1 mL，每日1次，共4周。同時，在開始皮下注射博萊霉素的當天，對照組、硬皮病組以0.9%NaCl灌胃，每日0.2mL，阿維A組則用0.5 mg/mL的阿維A溶液按照6 mg/（kg·d）劑量灌胃（依照人體給藥劑量0.5 mg/（kg·d）換算成小鼠的治療劑量為 6 mg/（kg·d），每日灌胃約 0.2 mL。

1.2.2 標本的留取 最后一次注射、灌胃24 h后，小鼠通過眼眶動脈放血處死，收集血液1～2 mL，以3000 r／min離心20 min，吸取上層血清，用 ELISA 法檢測 IL-17、IL-10、IL-6、TGF-β1水平，按試劑盒操作說明書進行。取小鼠背部無毛皮膚及肺臟，投入10%甲醛溶液中固定、脫水、石蠟包埋，制作組織病理切片。

1.2.3 皮膚和肺部炎癥、纖維化的觀察及測定 皮膚及肺組織切片行HE染色，用病理圖像分析軟件測量皮膚厚度（表皮+真皮厚度），皮膚和肺部炎癥按下述方法計分，0分:無；1 分:少許；2 分:輕度；3分:中度；4 分:重度。由兩名病理科醫(yī)生進行盲法閱片。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，符合正態(tài)分布的計量資料各組間比較采用方差分析。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠皮膚（背部注射部位皮膚）和肺部組織病理分析

皮膚組織病理切片HE染色顯示，對照組小鼠皮膚結構完整，無明顯炎癥細胞浸潤及膠原增生；硬皮病組小鼠皮膚厚度明顯增厚，膠原纖維增生，多數單一核細胞浸潤，毛囊皮脂腺等附屬器減少；阿維A組皮膚厚度稍增厚，未見明顯膠原增生，可見少量單一核細胞。

小鼠肺組織病理切片HE染色顯示，對照組肺結構完整，無明顯炎癥細胞浸潤；硬皮病組肺泡間隔明顯增寬，淋巴細胞浸潤，可見紅細胞及滲出，支氣管上皮增生；阿維A組肺泡間隔稍增厚，少量淋巴細胞浸潤及滲出。

阿維A組皮膚厚度、皮膚炎癥評分及肺炎癥評分均明顯低于硬皮病組，而與對照組無明顯差異。三組皮膚厚度、皮膚炎癥評分、肺部炎癥評分見表1。

表1 各組小鼠皮膚及肺部病理情況比較（±s）

表1 各組小鼠皮膚及肺部病理情況比較（±s）

組別 只數 皮膚厚度（μm） 皮膚炎癥評分（分）肺炎癥評分（分）對照組硬皮病組阿維A組F值P值888108.94±26.00191.88±40.95140.25±20.2415.250<0.0010.25±0.062.00±0.760.75±0.017.846<0.0201.13±0.352.00±0.921.38±0.5212.342<0.002

2.2 小鼠血清 IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1含量

阿維A組血清IL-17、IL-6、IL-10水平明顯低于模型組，而與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而模型組、對照組、給藥組三組血清TGF-β1差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表 2。

表2 各組小鼠血清 IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1含量（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠血清 IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β1含量（pg/mL，±s）

注:IL:白介素；TGF-β1:轉化生長因子 β1

組別 只數 IL-17 IL-6 IL-10 TGF-β1對照組硬皮病組阿維A組F值P值88852.42±6.9866.89±16.6250.69±11.724.109<0.03179.60±11.79118.68±22.6285.77±12.0613.307<0.00151.64±16.90131.07±22.5257.65±21.7437.103<0.001133.19±6.63137.56±9.00130.21±8.301.692<0.208

3 討論

系統(tǒng)性硬皮病可引起廣泛的皮膚硬化以及肺、腎、食管等多器官功能異常，多數患者預后不良。目前系統(tǒng)性硬皮病的治療策略主要是基于本病發(fā)生的三種基本機制:①針對血管痙攣，用血管擴張劑如鈣通道阻滯劑，和抗血小板聚集藥改善外周血循環(huán)；②針對免疫激活，用免疫抑制劑阻止有害細胞因子的合成和釋放，如環(huán)孢素，環(huán)磷酰胺，糖皮質激素等；③針對纖維增生和膠原沉積，用減少膠原合成和增加膠原酶的藥物抑制或減少纖維化，如D-青霉胺、秋水仙堿、γ-干擾素等[1，5]。但這些藥物僅能不同程度地緩解癥狀或有較大的副作用，使系統(tǒng)性硬皮病仍缺乏有效的治療方法。

阿維A為人工合成的第二代維A酸類藥物，具有調節(jié)細胞分化、抑制細胞增殖及調節(jié)免疫等作用。文獻報道[2]口服阿維A酯治療27例硬皮病樣的慢性移植物抗宿主病取得了明顯的療效。Marcellus等[3]觀察阿維A酯單用或聯(lián)合其他藥物治療12例SSc，并與糖皮質激素、D-青霉胺、環(huán)孢素等藥物治療進行比較，結果顯示使用阿維A酯治療的患者，臨床療效優(yōu)于其他藥物治療，而且起效快 （0.5個月）。崔盤根等使用阿維 A 0.5～0.6 mg／（kg·d）聯(lián)合血管擴張劑或其他藥物治療6例SSc患者，收到了良好效果，治療2周即可改善關節(jié)癥狀及皮膚硬化程度，且對SSc引起的某些內臟受累也有一定的療效[6]。博來霉素構建的小鼠硬皮病模型，可以很好的模擬人SSc的臨床特征，本試驗發(fā)現(xiàn)使用阿維A治療4周可以明顯改善硬皮病小鼠皮膚和肺部炎癥及纖維化，因此認為阿維A為治療SSc頗具前景的藥物。

Th17/Treg的發(fā)現(xiàn)更新了既往CD4+T細胞的研究以Th1/Th2為主要內容的觀點。CD4+T細胞在TGF-β和IL-6的共同誘導下分化為Th17，分泌IL-17和IL-6，促進炎性反應和自身免疫性疾病；而在TGF-β單獨的誘導下分化為Treg細胞，分泌TGF-β和IL-10，發(fā)揮免疫抑制及免疫調節(jié)作用[4]。近年來，Th17/Treg在SSc發(fā)病中的作用逐漸被人們所認識，萬琳琳等[7]發(fā)現(xiàn)SSc患者外周血Th17細胞比例、血清IL-17水平與活動組SSc患者的病情活動度呈正相關，提示Th17胞亞群在活動期SSc患者體內擴增，其擴增與SSc活動密切相關。在博來霉素誘導的小鼠硬皮病模型中也發(fā)現(xiàn)Th17細胞通過IL-17、IL-6等細胞因子參與SSc的發(fā)病，且與疾病程度呈正相關[8]。本試驗依照人治療劑量[阿維 A 0.5mg/（kg·d）]換算為小鼠治療劑量[阿維 A 6mg/（kg·d）]給予小鼠灌胃 4 周，顯著改善硬皮病小鼠皮膚和肺部癥狀，且血清IL-17、IL-6也顯著降低，提示阿維A對SSc的作用機制可能與影響Th17細胞有關。維甲酸相關 孤 獨 受 體 （retinoid related orphan nuclear receptor，RORγt）是控制 Th17 細胞分化的轉錄因子[4]，RORγt誘導編碼IL-17和IL-17F細胞因子基因的表達。當小鼠缺乏RORγt后，自身免疫性疾病發(fā)生率下降，Th17細胞數量也相應減少。文獻報道部分維A酸類藥物可與維甲酸相關孤獨受體（ROR）結合，抑制該基因的表達[9-11]，因此推測阿維A治療硬皮病的機制可能與藥物結合RORγt有關，導致了IL-17降低，以達到治療皮膚和肺臟纖維化的作用。本試驗中，筆者還發(fā)現(xiàn)阿維A治療組血清IL-10水平也顯著降低，而IL-10的水平在一定程度上反映了Treg細胞的水平。因此認為阿維A不僅作用于Th17細胞，而也可能影響了Th17/Treg的平衡。

阿維A作為皮膚科常用藥物之一，可明顯改善硬皮病小鼠皮膚及肺部癥狀，為臨床上治療SSc提供了新的思路，其作用機制可能與影響Th17/Treg的平衡有關。筆者進一步將繼續(xù)研究使用阿維A治療后外周血Th17細胞、Treg細胞各占CD4+細胞的百分比，檢測外周血單一核細胞中 IL-17、RORγt及叉頭狀螺旋轉錄因子 3（FoxP3）mRNA水平，以進一步明確阿維A對Th17/Treg的影響。

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