醫院制劑微生物限度檢查方法的重新驗證

黃依玲

藥品微生物試驗易受樣品成分、試驗條件等多種因素的影響，其結果不能真實反映樣品污染的微生物狀況。中國藥典2005版開始規定當建立藥品的微生物限度檢查法時，應進行檢驗方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌數的測定，若藥品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響到檢驗結果時，計數方法應重新驗證［1］。本實驗針對由于醫院由于整體搬遷，制劑生產、檢驗場所及配制制劑的原料生產廠家發生改變，對該院自制制劑的微生物限度檢查方法進行重新驗證，并與原來的檢驗方法進行比較和改進，結果總結如下。

1 試驗材料

1.1 樣品 氨茴香合劑、水合氯醛合劑、ORS-Ⅱ顆粒、10%氯化鉀溶液、33%和50%硫酸鎂溶液、復方硫酸鎂灌腸液、呋喃西林溶液、鼻軟膏、魚肝油軟膏、硫磺霜、復方苯酚含漱水、復方硫磺洗劑、痱子水、0.25%氯霉素溶液、爐甘石散劑、30%氧化鋅油、鏈霉素液狀石蠟滴鼻液(簡稱鏈石液)、呋喃西林麻黃素滴鼻液(O/W乳劑)、麻黃素滴鼻液、碳酸氫鈉滴耳液，共計21個品種，每個制劑品種均實驗3個批號。制劑的處方成分按中國醫院制劑規范及本院制劑規范。

1.2 試驗菌株 大腸埃希菌［CMCC(B)44102-1］、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003-1］、枯草芽胞桿菌［CMCC(B)63501-1］、銅綠假單孢菌［CMCC(B)10104-1］、白色念珠菌［CMCC(F)98001-1］、黑曲霉［CMCC(F)98001-1］由廣西食品藥品檢驗所提供，驗證試驗用菌株傳代次數為3～4代。

1.3 試劑 營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養肉湯培養基、膽鹽乳糖培養基(BL)、曙紅亞甲藍瓊脂培養基(EMB)、甘露醇氯化鈉培養基、十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養基、改良馬丁培養基(以上培養基由廣西食品藥品檢驗所提供)，蛋白胨(廣東環凱生物科技公司)，氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為分析純。

2 方法

實驗操作按中國藥典2010版二部附錄微生物限度檢查法［1］中細菌、霉菌及酵母菌計數方法和控制菌檢查方法的驗證規定進行。每樣品分別進行3次以上獨立的平行試驗，并分別計算各次試驗的回收率。

2.1 菌液制備 取實驗用菌，臨用前用0.9%氯化鈉溶液分別制備成每毫升含菌數為50～100cfu的菌懸液和孢子菌液，每次預計數。

2.2 供試液制備 用1∶10供試液進行實驗，需要特殊制備供試液的供試品如下：水溶媒的混懸劑如爐甘石散劑、復方硫磺洗劑，取樣品放置使充分沉降后，小心取上清液10 ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，制成1∶10的供試液。油性混懸制劑如30%氧化鋅油、鏈霉素石臘油滴鼻液放置使自然沉降后，小心取上層澄清油液10 g，加聚山梨酯10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液適量，攪拌使乳化，逐次加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，混勻，制成1∶10的供試液，放置使溶液穩定，取上清液待測。抑菌作用強乳膏劑如硫磺霜，取樣品5 g，加聚山梨酯5，卵磷酯1 g，充分攪均，逐次加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，攪均，放置使充分沉降后，取上清液以500轉/min離心3 min，取上層離心液作為1∶20供試液。

磺胺類軟膏劑如鼻軟膏，取樣品10 g，加45℃的乳化劑(5 g司盤80、3 g單硬脂酸甘油酯、10 g聚山梨酯80)，攪拌后，逐次加入45℃的 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，加1%PABA5 ml，制成1∶10 供試液，放置使自然沉降后取上清液待測。乳化劑和稀釋劑已做稀釋劑對照組實驗，回收率均＞70%。

2.3 驗證試驗

2.3.1 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證 試驗組：取按2.2制備的供試液1 ml和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，傾入瓊脂培養基，每株實驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。

菌液組：用平板法分別測定所加各菌株的試驗菌數。供試品對照組：取與實驗組同一供試液測定供試品本底菌數。計算回收率(試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率)應不低于70%。

實驗結果21個品種中有10%氯化鉀溶液等9個品種用常規方法試驗，對6個實驗菌均無抑菌作用，回收率均＞70%，與上次驗證的實驗方法無變化;而有些品種的有些試驗菌回收率低于70%，有些品種的實驗操作方法需作改進，見表1。

表1 計數驗證各試驗菌回收率(n=3，%)

2.3.2 控制菌檢驗方法的驗證 試驗組：取按2.2制備的供試液10 ml及50～100cfu試驗菌加入增菌培養基中，依相應控制菌檢查法檢查，應檢出試驗菌。

陰性對照組：方法同試驗組，驗證大腸埃希菌的陰性對照用金黃色葡萄球菌，銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌的陰性對照均用大腸埃希菌，陰性對照菌應不得檢出，以驗證該控制菌檢查方法的專屬性。

結果大多數品種按常規法檢查無抑菌作用，少數制劑通過培養基稀釋和延長增菌培養時間即可排除實驗干擾，見表2。

表2 控制菌檢查方法驗證結果

3 討論

3．1 與原方法結果比較，部分制劑微生物檢驗方法有所變化，如氨茴香合劑原來用培養基稀釋法，重新驗證后用常規平皿法即可使實驗菌達到規定的回收率，而33%、50%硫酸鎂溶液原來用常規平皿法培養，重新驗證結果3次平行實驗中有的批次枯草桿菌回收率不能達到70%，因此采用薄膜過濾法。這說明了重新驗證的必要性。

3．2 經實驗摸索，將原有些劑型的實驗方法做有效的改進，使操作更加簡便易行，各實驗菌得到最穩定的回收率。如有抑菌作用的水溶性制劑如硫酸鎂溶液等，或制備成水溶性的供試液如30%氧化鋅油，無論抑菌作用強弱，一律用薄膜過濾法，此法比培養基稀釋法使用平皿少，實驗結果穩定，器皿易清洗，熟練后操作簡便易行;對于混懸液的樣品如30%氧化鋅油、鏈石液等，在制備1∶10供試液前，取數瓶足量的樣品混合后，靜置使充分沉降，小心吸取上清油液，加聚山梨酯80進行乳化，再加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，制成充分分離不溶性成分的1∶10供試液，使在薄膜過濾時快速易沖洗，避免了原來的檢驗方法中將樣品搖勻后取樣制備成1∶10供試液，再進行沉降和低速離心，這樣不能將混懸液中不溶性成分充分分離，無法有效進行薄膜過濾和沖洗;對于沉降及低速離心均不易分離的制劑如硫磺霜、呋喃西林麻黃素滴鼻液(乳液)，以及含乙醇制劑如痱子水在用水稀釋制備1∶10供試液時由于樟腦等成分析出產生少量混濁的樣品，不溶性成分不能完全分離，原來用的薄膜過濾法因堵塞不能有效過濾，應用培養基稀釋法。

3．3 控制菌檢查中因有增菌培養，很多在細菌計數時有抑菌的品種，在控制菌檢查中能檢出試驗菌。除了對抑菌活性較強的抗生素品種用薄膜過濾法外，其余制劑用培養基稀釋法延長增菌時間能有效排除抑菌作用。

［1］ 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(二部)2010版，北京：化學工業出版社，2006：附錄107-116．