3種常見醫藥品對發光菌聯合毒性作用研究

董玉瑛，朱行翠，仉春華

(大連民族學院環境與資源學院，遼寧大連116605)

長期以來，人類藥品在保障人們健康、延長人類壽命、改善人民生活水平等方面起到重要的作用。但是這些藥物中的活性醫藥成分(Active Pharmaceutical Ingredient，APIs)(如原料藥或藥物的代謝物)能夠釋放到環境中，產生潛在的環境危害。近年來在排水、水源地水、管道水、飲用水中，都檢測到了人類使用的各種醫藥品的存在［1-3］。然而，目前對醫藥物質的研究主要集中在臨床應用、體內的代謝動力學等方面，從生態毒理學角度進行的APIs進入環境后的毒性效應研究較少。人們對這些APIs的環境風險性了解甚微，更無法預測暴露于含有這些混合藥物的環境后可能發生的后果［4］。

本文結合發光菌快速、靈敏、價廉的優點，將其作為指示生物測定了阿司匹林、環丙沙星和阿奇霉素3種常用藥品對發光菌的單一毒性，獲得EC50值;同時測試了3種藥品在等濃度配比下的二元、三元混合體系的聯合毒性。采用毒性單位(TU)法、相加指數(AI)法、混合毒性指數(MTI)法等聯合毒性評價方法，判斷其聯合作用機制，并分析環境中藥品殘留問題的風險性。

1 材料與方法

1.1 材料

阿司匹林腸溶片(湖南新匯制藥有限公司)，鹽酸環丙沙星片(哈藥集團制藥總廠)，阿奇霉素分散片(沈陽恩世制藥有限公司)。明亮發光桿菌(Photobacterium phosphoreum)凍干粉購自中國科學院南京土壤研究所微生物室。

1.2 儀器

DXY-2型生物毒性測試儀(中國科學院南京土壤研究所制造)，85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)，THZ-82氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇儀器廠)，DHP-9082電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)，LDZX-40CI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)，不同量程的精密移液器(Thermo公司)，SJH型潔凈工作臺(沈陽市凈化儀器廠二分廠)，常規玻璃儀器。

1.3 試劑

培養液:酵母浸出汁5.0 g，胰蛋白胨5.0 g，氯化鈉(NaCl)30.0g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)5.0 g，磷酸二氫鉀(KHm2PO4)1.0 g，甘油 3.0 g，蒸餾水1 000 mL。

固體培養基:培養液(按以上配方)100 mL，瓊脂粉6 g。

稀釋液:2%NaCl，3%NaCl。

待測物:阿司匹林腸溶片(湖南新匯制藥有限公司)、鹽酸環丙沙星片(哈藥集團制藥總廠)、阿奇霉素分散片(沈陽恩世制藥有限公司)。

1.4 菌種的培養

發光菌凍干粉劑的復蘇、斜面菌種的培養、搖瓶菌液的培養、工作菌液的制備等過程見文獻［5］。

1.5 單一毒性EC50的測定

(1)預試驗:將藥品研磨配制水溶液，以逐級10倍稀釋法選擇高、中、低3個試驗濃度進行預試驗，獲得接近100%、0%抑制率的APIs濃度。另外抑制率在50%左右的APIs濃度也需要計算，以作為正式試驗的布點參考。

(2)單一毒性試驗:根據預試驗的結果，將待測溶液用3%NaCl溶液稀釋配制成10～15個濃度梯度，各取4.5 mL加入具塞磨口比色管(φ 1.5 cm，h6cm)，以4.5 mL 3%NaCl溶液作空白對照。每個濃度梯度設3組平行。將培養好的工作菌液取0.5 mL于各比色管中(控制空白對照管發光強度為300～900 mV)，加塞充分振蕩，去塞，暴露15 min，用生物毒性測試儀測定暴露于不同APIS溶液中發光菌的發光強度。

1.6 聯合毒性EC50的測定

按等濃度比配制3種APIs的二元及多元混合體系，根據預實驗結果設6個不同濃度，測定混合體系對發光菌的聯合毒性EC50值，實驗步驟與單一毒性EC50測定相同。

1.7 數據處理

毒性效應結果用相對抑制率表示:

采用Origin7.5繪圖軟件，以APIS濃度為橫坐標、相對抑制率為縱坐標繪制毒性測試曲線。并在相對抑制率為50%附近的點進行回歸分析，求得回歸方程，用直線內插法求出該種APIs對發光細菌的發光強度抑制率為50%時所對應得濃度，即為 EC50。

1.8 聯合毒性評價方法

本文采用毒性單位法(TU)、相加指數法(AI)和混合毒性指數法(MTI)3種聯合毒性評價方法，其中各參數的計算和意義見文獻［6］。

2 結果與討論

2.1 單一毒性測試分析

測定了3種APIs對發光細菌的單一毒性，其生物毒性測試曲線見圖1-圖3。從圖中可以觀察到單一APIs對發光菌發光強度的抑制曲線呈現單調非線性遞增趨勢，整個圖線大致呈現“S”型。APIs對生物的毒害程度與其在環境中的濃度存在著很大的相關性［7］。

圖1 阿司匹林的抑制曲線

圖2 環丙沙星的抑制曲線

圖3 阿奇霉素的抑制曲線

由3種APIs對發光細菌的單一毒性，計算求得其EC50結果見表1。由表1可以看出，3種APIs對發光菌的發光強度表現出不同程度的抑制作用，其EC50值大小順序為:環丙沙星＞阿奇霉素＞阿司匹林。進而可知，環丙沙星的生物毒性最小，環境風險也最低;阿司匹林的對環境的毒性危害最大，進入環境后的風險性也較其余2種藥品的環境風險高。

表1 3種醫藥物質的單一毒性作用

2.2 聯合毒性測試分析

實際環境中往往是多種污染物共存，它們彼此影響，能大大改變某一或某些污染物的生物活性或毒性，使得環境污染往往表現為多種污染的綜合作用，單一物質的測定不能滿足實際環境保護的需要，因此研究環境中多種污染物的復合作用規律與機制，了解污染物的復合生態環境效應及其與單個化合物污染影響的差異，具有重要的理論和現實意義。本文分別測定了3種APIs的二元及三元混合體系對發光細菌的聯合毒性，結果見表2。

表2 混合體系聯合毒性作用

由表2可知，3種APIs的二元混合體系對發光細菌表現出不同程度的抑制作用，其EC50值大小順序為:環丙沙星-阿奇霉素＞阿司匹林-阿奇霉素＞阿司匹林-環丙沙星。環丙沙星-阿奇霉素混合體系的聯合毒性最小;阿司匹林-環丙沙星混合體系對發光細菌的毒性最大。三元混合體系(阿司匹林-環丙沙星-阿奇霉素)的EC50值小于二元混合體系(環丙沙星-阿奇霉素)的EC50值，即環丙沙星-阿奇霉素混合體系在加入阿司匹林以后，其EC50值有所減小。這種變化，體現了不同性質的官能團對聯合作用的不同影響。

2.3 聯合毒性作用類型分析

分別采用毒性單位法(TU)、相加指數法(AI)和混合毒性指數法(MTI)對混合體系的聯合毒性進行評價，獲得了一致性的結果(見表3)，即阿司匹林-阿奇霉素和環丙沙星-阿奇霉素二元混合體系、阿司匹林-環丙沙星-阿奇霉素三元混合體系的聯合毒性作用類型均為拮抗作用;阿司匹林-環丙沙星二元混合體系的聯合毒性作用類型為部分相加。

表3 毒性單位法(TU)評價聯合毒性作用類型結果

2.4 聯合毒性作用評價方法靈敏度分析

為了較直觀的比較3種不同的聯合毒性評價方法對某聯合體系的靈敏程度與適合程度，董玉瑛等應用M0-M、AI、MTI-1數值大小代表協同作用的強度［8］。對表現為拮抗作用的3組聯合體系的評價指數作進一步處理，認為M-M0、-AI、1-MTI數值大小可以代表拮抗作用的強度。三元混合體系與其他兩種二元混合體系相比，其拮抗作用最強(如圖4)，同時顯示混合毒性指數法參數數值較大，判定其靈敏度較高，可作為該研究體系的推薦評價方法。

圖4 3種不同聯合毒性評價方法的比較

2.5 聯合毒性作用機制初步探討

綜合分析二元及三元混合體系聯合毒性評價結果可以看出，除了阿司匹林與環丙沙星混合體系的聯合毒性表現為部分相加作用之外，其余的幾組混合體系均表現為拮抗作用。對于呈現的這些聯合作用類型，可從發光菌的發光原理、APIs的結構性質和特殊藥效，進行初步的聯合毒性機理分析。

在明亮發光桿菌的發光反應中，FMNH2被氧化成FMN的過程中起到了傳遞氫的作用［9］。外源性污染物質可干擾或損害細菌呼吸或生理過程，阻礙正常的發光反應，影響傳遞氫的作用，致使發光細菌的發光受到抑制。本文研究的聯合毒性產生拮抗作用的原因，可能是由于環丙沙星和阿奇霉素分子中均含有N元素，對于FMNH2分子而言是一種營養元素，可以一定程度上促進FMNH2對氫的傳遞作用，進而減弱單一物質的阻礙作用，表現為拮抗作用。目前由于認識水平、研究方法和技術上的限制，對于聯合作用機制尤其是多元混合體系的聯合作用機制的了解尚不夠充分。

3 結論

(1)阿司匹林、鹽酸環丙沙星和阿奇霉素3種常見醫藥品組成的二元和多元混合體系的毒性，除阿司匹林-環丙沙星二元混合體系的聯合毒性作用類型為部分相加，其他均表現為不同程度的拮抗作用。

(2)不同評價方法對二元和多元混合體系的協同強弱評價結果呈現出一致的順序，是聯合毒性評價的可行性方法。其中以混合毒性指數法的參數數值較大，判定靈敏度較高，為該研究體系的推薦評價方法。

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