味覺厭惡學習對大鼠舌乳頭上皮leptin表達的影響

李海艷，程振宇

(承德醫學院，河北承德 067000)

動物攝取某種新異的味覺刺激后，若出現惡心、嘔吐、腹瀉等內臟不適，動物便可“記住”這種食物的味覺特征，減少或拒絕攝取具有相同味覺特征的食物，這種行為的變化過程稱為條件性味覺厭惡學習(CTA)，是動物避免重復攝取有毒物質的一種重要學習機制。味覺對于調節攝食，控制體重起著重要作用。脂肪細胞產生的瘦素(leptin)能夠調整食物的吸收、能量的消耗和體重。目前認為，味覺器官是leptin作用于外周的靶器官之一，leptin通過與味覺細胞的ob-Rb受體結合抑制機體對甜味物質的反應，降低味覺感受器的敏感性。因此，由leptin引起的味覺改變可能參與了對食物吸收的調整[1]。本研究通過建立大鼠CTA模型，采用免疫組化染色法觀察了CTA模型大鼠舌乳頭上皮leptin表達的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 清潔級成年雄性SD大鼠20只，體重250-300g，購自河北醫科大學實驗動物中心(許可證號:SCXK(冀)2008-1-003)。大鼠隨機分為CTA組和對照組，每組10只大鼠，兩組均進行口腔插管手術，建立模型時CTA組腹腔注射LiCl(20ml/kg)、對照組腹腔注射生理鹽水(20ml/kg)。

1.2 CTA模型的建立

1.2.1 口腔插管手術:大鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉，固定于腦立體定位儀上，暴露頂骨。將醫用單孔聚乙烯管的一端，由皮膚切口處經耳眼間皮下組織導入大鼠頰部并穿入口腔，在口腔內加一墊圈固定;在頂骨表面固定兩個螺絲釘，將導管上端用牙托粉固定于螺絲釘上，傷口處灑上滅菌結晶磺胺消炎。

1.2.2 建立模型:口腔插管手術后3-5d，經口腔插管向口腔內注入0.2mol/L蔗糖溶液5ml，5min內注完;20min后，腹腔注射0.15mol/L的LiCl(20ml/kg)。禁食禁水12h后，用兩瓶法測定水和蔗糖的攝取量。如果對蔗糖的攝取量小于0.5ml，說明建立了一次CTA，重復建立3次予以鞏固。

1.3 免疫組織化學染色法檢測leptin的表達 造模成功后，大鼠腹腔注射25%氨基甲酸乙酯(2g/kg)麻醉，打開胸腔暴露心臟，經升主動脈插管，150ml生理鹽水快速灌流沖洗，然后用4%多聚甲醛灌流固定1.5h，取舌，入4%多聚甲醛后固定4-6h，常規石蠟包埋，連續切片，片厚5μm。采用SP免疫組織化學染色法觀察大鼠舌leptin的表達，兔抗leptin多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)1:300稀釋，DAB(美國Sigma公司)顯色，蘇木素復染。陰性對照以PBS代替一抗。

1.4 切片觀察和細胞計數 每只大鼠觀察5張切片，每張切片在200倍顯微鏡下取6個視野，Image-Pro Plus(IPP)分析軟件系統自動計數兩種舌乳頭上皮限定面積(絲狀乳頭和菌狀乳頭，270μm×250μm)內陽性細胞的數目，換算為單位面積內leptin陽性細胞數(/mm2)，取平均值作為該舌乳頭上皮leptin蛋白表達的相對水平。

1.5 統計學處理 采用SPSS 14.0統計軟件處理數據，兩樣本均數的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

絲狀乳頭、菌狀乳頭和輪廓乳頭上皮均可見leptin免疫反應陽性細胞，leptin陽性產物位于細胞質，呈棕黃色。與對照組比較，CTA組大鼠舌乳頭上皮的染色明顯加深，且CTA組大鼠舌絲狀乳頭、菌狀乳頭上皮leptin的表達水平明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P＜0.01)。見附表。

附表 各組大鼠舌乳頭上皮leptin的表達(±s，單位:細胞數/mm2)

附表 各組大鼠舌乳頭上皮leptin的表達(±s，單位:細胞數/mm2)

組別 n 絲狀乳頭 菌狀乳頭對照組 10 84.66±6.23 60.91±17.25 CTA組 10 173.55±15.07 179.42±26.13 P ＜0.01 ＜0.01

3 討論

leptin是肥胖基因(ob基因)的蛋白產物，主要在脂肪組織中表達，被認為是一種飽食信號，主要調節能量平衡和控制體重。向遺傳性肥胖小鼠(ob小鼠)的腦脊液注入leptin后，小鼠的進食量明顯減少，體質量也逐漸下降[2]。Monteleone等[3]和Waelput等[4]發現，leptin具有廣泛的生物學效應:一是通過作用于下丘腦的攝食中樞產生飽脹感，從而抑制攝食行為;二是作用于其它組織的leptin受體，包括肝、脾、肺、腎、心、胰腺等，直接或間接發揮生物學效應[5]。目前，有研究認為leptin也可作用于味覺器官。

動物建立味覺厭惡學習后，有惡心、嘔吐、腹瀉等內臟不適的表現，對攝食的適應性調節能力降低，進而導致胃排空的延遲。leptin水平及其受體表達的多少和性狀的改變，可以改變胃的順應性，抑制攝食，延遲胃排空。原因是leptin可直接激活迷走神經傳入神經元，刺激信號通過迷走神經到達孤束核(NTS)刺激leptin敏感神經元，再作用于下丘腦外側區(LH)、下丘腦腹內側區(VMH)及弓狀核(ARC)，抑制胃的運動和攝食，因此提示leptin能夠調節攝食、調節胃排空[6]。近年有研究報道，leptin還能影響小鼠的記憶和學習活動。敲除leptin受體基因的db/db小鼠，依然能建立條件性味覺厭惡學習，但卻加快了CTA的消退過程，原因可能是leptin受體差異性地分布于CTA相關腦區[7]。另外，leptin可能通過杏仁核、海馬、皮質、臂旁核的leptin受體發揮作用，而且leptin受體在CTA大鼠腦內神經元中表現出內移現象，表明在CTA的形成和維持中，leptin受體的活性或功能發生了變化，提示leptin在味覺和內臟信息的相互作用中具有重要作用[8]。而CTA也是味覺信息和內臟信息發生整合作用的結果，動物建立CTA后是否會影響外周器官—舌leptin的表達，目前尚未見相關報道。

本研究發現，大鼠絲狀乳頭、菌狀乳頭及輪廓乳頭上皮均可見leptin表達，并且CTA大鼠舌絲狀乳頭、菌狀乳頭上皮leptin的表達水平明顯高于對照組大鼠;因此提示CTA影響了leptin蛋白在舌乳頭上皮的表達，進一步闡明了CTA和leptin蛋白的關系，充實了CTA理論，但相關機制有待于深入研究。

[1]Shigemura N,Ohta R,Kusakabe Y, et al. Leptin modulate behavioral responses to sweet substances by influencing periphera taste structures[J].Endocrinology,2004,145(2):839-847.

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[3]Monteleone P, DiLieot A,Castaldo E, et al. Leptin functioning i eating disorders[J]. CNS spectr, 2004, 9(7): 523-529.

[4]Waelput W, Brouckaert P, Broekaert D, et al. A role for lepti in the systemic inflammatory response syndrome(SIRS) an in immune response [J].Curr Drug Targets Inflamm Allergy 2002,1(3):277-289.

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[7] Ohta R, Shigemura N,Sasamoto K, et al. Conditioned taste aversion learning in leptin-receptor-deficient db/db mice[J]. Neurobiol Learn Mem,2003,80(2):105-112.

[8]韓蓁，閆劍群，宋新愛，等.瘦素受體在條件性厭味大鼠腦的表達[J].第四軍醫大學學報，2003，24(1):11-13.