Aβ1～42寡聚體與纖維體的制備及鑒定

楊 帆 李東風(fēng) 徐書(shū)雯 (南方醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東 廣州 50080)

β淀粉樣蛋白(Aβ)毒性學(xué)說(shuō)是阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的主流學(xué)說(shuō)〔1，2〕。大量的Aβ沉積形成老年斑是AD最具特征性的病理改變〔3〕。已知在 AD老年斑周?chē)奂罨男∧z質(zhì)細(xì)胞，Aβ可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎癥因子〔4，5〕，從而對(duì)神經(jīng)元在內(nèi)的各種細(xì)胞造成損傷甚至凋亡。Aβ以寡聚體或纖維體兩種狀態(tài)存在，這兩種狀態(tài)的Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞功能損傷的強(qiáng)度不同〔6〕。一般認(rèn)為，Aβ寡聚體的毒性較纖維體更強(qiáng)，因此，近年來(lái)關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的研究一般以寡聚體刺激造模為主。但由于寡聚體的穩(wěn)定性較差，易向纖維體轉(zhuǎn)化〔7〕，體外研究操作時(shí)間窗相對(duì)較短，所以使用寡聚體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，對(duì)其進(jìn)行鑒定就顯得尤為重要，但目前關(guān)于Aβ聚集狀態(tài)的鑒定方法報(bào)道較少。為此，本實(shí)驗(yàn)先制備不同聚集狀態(tài)的 Aβ1～42，然后鑒定兩種 Aβ1～42形態(tài)，進(jìn)一步證實(shí)Aβ1～42聚集形態(tài)與神經(jīng)毒性作用的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株(BV2)購(gòu)自武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，Aβ1～42購(gòu)自ENZO公司，腫囊收縮素-8(CCK-8)試劑盒購(gòu)自日本同仁公司，原子力顯微鏡(AFM，本原納米儀器公司，型號(hào)CSPM5500)。

1.2 方法

1.2.1 BV-2細(xì)胞培養(yǎng) 將BV-2細(xì)胞株接種到含10%胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每3 d傳代一次，用0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化。

1.2.2 Aβ1～42寡聚體和纖維體的制備 將1 mg Aβ1～42粉末溶于冷卻的六氟異丙醇(HFIP)220 μl中，室溫孵育60 min使Aβ1～42充分溶解，將Aβ肽-HFIP放置在冰上5～10 min后移至通風(fēng)櫥內(nèi)，打開(kāi)瓶蓋以便HFIP揮發(fā)。風(fēng)干后形成透明的Aβ肽膜，溶解于44 μl新鮮無(wú)水100%二甲基亞礬(DMSO)，制成5 mmol/L Aβ1～42合成肽。

(1)寡聚體制備:用無(wú)含酚紅的F12培養(yǎng)液將5 mmol/L Aβ1～42合成肽稀釋成終濃度 50 nmol/L，4℃ 孵育 24 h 后，以4℃、14 000 r/min 離心 10 min，取上清液即為 Aβ1～42寡聚體，置于-80°C冰箱保存。

(2)纖維體制備:將 5 mmol/L Aβ1～42合成肽溶于10 mmol/L HCl，并稀釋成終濃度50 nmol/L，然后放置在37℃溫箱孵育24 h即為纖維體，置于-80℃冰箱保存。

1.2.3 AFM鑒定 將Aβ1～42寡聚體和纖維體制成品分別滴于新鮮解離的云母片上，室溫下靜置5 min后用去離子水輕柔沖洗，干燥皿中干燥10 min。將制備好的 Aβ1～42樣品在 AFM下觀察，先用接觸模式掃描到云母片上的生物制品，再改用輕敲模式進(jìn)行掃描。輕敲模式參數(shù):力常數(shù)40 N/m，共振頻率300 kHz，掃描頻率1 Hz。圖像處理軟件為Imager 4.60。

1.2.4 CCK-8細(xì)胞存活率測(cè)定 在96孔板上以每孔10 000個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞種板，加入無(wú)血清DMEM/F12高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后加入不同濃度Aβ1～42寡聚體和纖維體，共同作用24 h后吸除上清液，每孔加入180 μl培養(yǎng)基L+20 μl CCK-8試劑避光共同孵育，待2 h后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm OD值。重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài) 細(xì)胞呈兩種形態(tài):一種為圓形或橢圓形、折光性強(qiáng)的小細(xì)胞，是處于一定活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞;另一種呈不規(guī)則胞體，且有細(xì)長(zhǎng)突起，是處于靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

2.2 AFM鑒定Aβ1～42的不同聚集狀態(tài) AFM下不同聚集狀態(tài)Aβ1～42的形態(tài)有差別。Aβ1～42寡聚體呈球狀或橢圓球狀顆粒，高度為5 nm左右;而Aβ1～42纖維體在鏡下呈現(xiàn)長(zhǎng)條纖維狀聚集，高度約為3 nm左右，長(zhǎng)度＞1 000 nm。見(jiàn)圖2。

圖1 BV-2細(xì)胞形態(tài)(×400)

圖2 AFM鑒定Aβ1～42的聚集狀態(tài)

2.3 CCK-8法比較不同聚集狀態(tài)Aβ1～42對(duì)BV-2細(xì)胞存活率的影響 無(wú)論纖維體還是寡聚體，Aβ1～42對(duì)BV-2細(xì)胞均有損傷作用，并且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)，在同樣濃度水平的條件下，自0.1 μmol/L濃度起，寡聚體的毒性作用均比纖維體更顯著(P＜0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 不同聚集狀態(tài)Aβ1～42對(duì)BV-2細(xì)胞存活率的影響

3 討論

AD的發(fā)病機(jī)制迄今未完全清楚，而Aβ毒性學(xué)說(shuō)最受關(guān)注。Aβ是由淀粉樣前體蛋白水解所產(chǎn)生的多肽，有兩種主要存在形式:Aβ1-40和Aβ1～42，共存于老年斑中。在正常情況下，Aβ的產(chǎn)生和降解過(guò)程保存平衡，但在AD患者腦中，這種平衡狀態(tài)受到破壞，導(dǎo)致 Aβ的異常聚集沉積形成老年斑〔8〕。Aβ1～42毒性較Aβ1-40強(qiáng)，更易發(fā)生聚集沉積形成老年斑。

研究發(fā)現(xiàn) Aβ1～42的聚集狀態(tài)與其神經(jīng)毒性關(guān)系密切，Aβ1～42形成可溶性寡聚體時(shí)的神經(jīng)毒性強(qiáng)于其他不可溶性Aβ物質(zhì)〔9〕。

AFM是一種可用來(lái)研究固體材料表面結(jié)構(gòu)的顯微鏡，其橫向分辨率為23 nm，縱向分辨率為0.5 nm。AFM通過(guò)檢測(cè)待測(cè)樣品表面和一個(gè)微型力敏感元件(探針)之間的極微弱的原子間相互作用力來(lái)研究物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，可以納米級(jí)分辨率獲得直觀的物體表面結(jié)構(gòu)信息。AFM已成為研究生物醫(yī)學(xué)樣品和生物大分子的重要工具之一。近年來(lái)，AFM越來(lái)越多地被應(yīng)用于核酸、多肽、蛋白質(zhì)、微生物和細(xì)胞等方面研究。目前常用于鑒定Aβ1～42聚集狀態(tài)的方法包括有硫磺素T(ThT)熒光光譜分析、電子顯微鏡等〔10〕。AFM在分辨率方面較電子顯微鏡更具優(yōu)勢(shì)，原子力分辨率最高達(dá)到原子級(jí)0.1 nm，而掃描電子顯微鏡達(dá)到6～10 nm，且AFM成像可得到三維立體的圖像，其樣本制作要求比較簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境要求也低。AFM可以在自然狀態(tài)(空氣或者液體)下對(duì)生物醫(yī)學(xué)樣品直接進(jìn)行成像。基于AFM的顯著優(yōu)點(diǎn)，本研究嘗試應(yīng)用該手段對(duì)Aβ1～42的聚集狀態(tài)進(jìn)行鑒定。

AFM的掃描模式可分為非接觸模式、接觸模式和輕敲模式，因 Aβ1～42為非常柔嫩、易變形的樣品，故在本研究中，工作模式先選用接觸模式在云母片上掃描到樣品后再改用輕敲模式周期性地短暫地接觸樣品表面進(jìn)行成像掃描，將對(duì)Aβ1～42形態(tài)改變的影響降至最小，最大程度呈現(xiàn)Aβ1～42的表面結(jié)構(gòu)。在制備Aβ1～42聚集狀態(tài)的過(guò)程中觀察到:Aβ1～42單體溶于 DMSO后，先形成合成肽，經(jīng)過(guò)4℃孵育24 h后形成寡聚體，但隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)至超過(guò)48 h后，寡聚體狀態(tài)漸聚集成纖維體狀態(tài)，寡聚體在常溫狀態(tài)不穩(wěn)定，需放置于-80℃保存。因?yàn)锽V-2細(xì)胞表面有其他蛋白物質(zhì)存在，所以AFM無(wú)法在BV-2細(xì)胞表面直接觀察到Aβ的狀態(tài)。

Aβ1～42的神經(jīng)毒性作用非常復(fù)雜，可通過(guò)多條途徑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成不同程度及不同類(lèi)型的損害，例如可通過(guò)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、干擾膽堿能系統(tǒng)等作用促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，造成記憶、認(rèn)知功能的損害。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Aβ1～42寡聚體比纖維體更具細(xì)胞毒性，與先前報(bào)道一致〔11，12〕。然而，本實(shí)驗(yàn)所證實(shí)的Aβ細(xì)胞毒性作用是基于體外研究結(jié)果，其在AD顱腦內(nèi)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的實(shí)際作用過(guò)程是否完全一致，尚有待進(jìn)一步研究。

總之，Aβ1～42寡聚體以及纖維體兩種不同聚集形態(tài)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用具有顯著差異。本研究介紹的AFM鑒定則為此提供了一種簡(jiǎn)單、直觀又準(zhǔn)確的手段。

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