帕病1號方對帕金森病模型大鼠的神經保護作用①

趙彩燕，雒曉東，林明欣，蘇巧珍，鄭春葉

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種常見的神經系統退行性變疾病，以運動減少、肌肉強直和震顫為主要癥狀。主要的病理學特征為黑質(SN)致密部多巴胺能神經元選擇性變性。引起帕金森病理改變的確切病因目前尚不清楚，可能與氧化應激、神經營養因子缺乏等有關，其共同通路為細胞凋亡[1]。

中藥復方在帕金森病的神經保護作用上可發揮多重靶標優勢[2]，有很好的應用前景。帕病1號方為治療帕金森病系列驗方之一，對美多芭難以改善的非多巴胺能運動癥狀和非運動癥狀[3]有顯著臨床療效。本文研究其對帕金森病大鼠的神經保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠85只，4～5月齡，體重210～280 g，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(粵)2008-0020。

1.2 試劑及儀器

6-羥基多巴胺(6-OHDA)、阿撲嗎啡(APO)：美國SIGMA公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)抗體：北京博奧森生物技術有限公司；Bcl-2抗體、Bax抗體、兔IgG SABC-POD試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；腦立體定位儀：上海江灣II型；307-6型臺式牙鉆車：上海醫用分析儀器廠；10 μl微量進樣器：上海醫用激光儀器廠；721型分光光度計：上海第三分析儀器廠；圖像分析儀：北航多媒體真彩色病理分析圖文分析系統。

中藥帕病1號方顆粒劑，由江陰天江藥業有限公司生產，廣東省中醫院藥學部統一購進。藥物組成：烏梅、白芍、山萸肉、當歸、熟附子、熟地黃、黃連、川芎、葛根、炙甘草、何首烏、人參、石菖蒲，按顆粒藥實際重計，每劑43 g。

1.3 造模

大鼠腹腔注射阿撲嗎啡0.5 mg/kg，無旋轉行為。10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉。頭部毛發備皮，固定于腦立體定位儀上，參照文獻方法[4]確定左側紋狀體(CPU)兩點坐標：前囟嘴側1.6 mm，中線左側2.8 mm，深5.0 mm；前囟尾側1.0 mm，中線左側旁開4.5 mm，深5.0 mm。在相應部位用牙科鉆鉆透顱骨，微量進樣器吸取5 μg/μl 6-OHDA，緩慢進針達預定深度，以1 μl/min速度注入，留針10 min，緩慢退出，縫合皮膚。

1.4 行為學檢測

術后1、2、3周行旋轉實驗。大鼠腹腔注射阿撲嗎啡0.5 mg/kg，10 min后記錄30 min內旋轉圈數。若大鼠恒定轉向右側，且最大轉速＞7 r/min，30 min內旋轉＞150轉，視為造模成功[5]。治療后同法測試。

1.5 分組

造模成功的大鼠40只，完全隨機法分為模型組12只，高劑量組14只，低劑量組14只；另加正常組8只。高劑量組、低劑量組分別給予帕病1號方顆粒18 g/kg、9 g/kg，均以蒸餾水4 ml溶解藥物灌胃；正常組、模型組予蒸餾水4 ml灌胃。每天1次，共32 d。

1.6 紋狀體SOD活性、GSH和MDA含量測定

治療后第2天，10%水合氯醛深度麻醉動物，處死大鼠。冰枕上迅速取腦，冰生理鹽水中快速去除腦膜和血管，分離大鼠左側紋狀體，冰生理鹽水中漂洗除去血液，精密稱重，加入9倍生理鹽水冰浴勻漿。應用考馬斯亮藍法測勻漿上清液中SOD活性、GSH及MDA含量，按照試劑盒說明書進行。

1.7 P-Akt、Bcl-2及Bax免疫組織化學染色(SABC法)

10%水合氯酸深度麻醉，左胸前壁縱行剪開心包，暴露心臟，剪開右心耳，左心尖處插入灌流針。先用PBS進行灌流，待血液沖洗干凈后，再灌流4%多聚甲酸300 ml，斷頭取中腦，置4%多聚甲酸緩沖液固定24 h以上，脫水、常規石蠟包埋。參照圖譜，每只大鼠中腦黑質部位各取21張切片，每個指標用7張。參考試劑盒說明書進行P-Akt、Bcl-2和Bax免疫組化染色，對照組切片用0.1 mol/L PBS代替一抗。鏡下胞質中出現棕黃色顆粒判定為陽性神經細胞。結果以每組每個視野免疫陽性神經細胞的平均數表示。所有資料均由分析系統自動計算并打印。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 行為學檢測

正常組未誘導出旋轉行為。模型組大鼠治療前后旋轉圈數無顯著性差異(P＞0.05)。各PD組大鼠治療前旋轉圈數無顯著性差異(P＞0.05)；治療后，各PD組大鼠旋轉圈數有非常高度顯著性差異(P＜0.001)；且其中高、低劑量組治療后旋轉行為均顯著改善(P＜0.001)，并明顯低于模型組(P＜0.01)，且高劑量組明顯低于低劑量組(P＜0.01)。見表1。

2.2 氧化應激反應

與正常組相比，模型組SOD活性及GSH含量均明顯降低(P＜0.01)，MDA含量明顯升高(P＜0.01)。與模型組相比，高劑量組SOD活性(P＜0.01)、GSH含量(P＜0.01)明顯提高，MDA含量明顯降低(P＜0.01)；低劑量組SOD活性無顯著改變(P=0.594)，GSH含量明顯提高(P＜0.01)，MDA含量明顯降低(P＜0.01)。與低劑量組相比，高劑量組SOD活性無顯著改變(P=0.187)，GSH含量明顯提高(P＜0.01)，MDA含量明顯降低(P＜0.01)。見表2。

2.3 免疫組織化學

與正常組比較，模型組P-Akt(ser 473)、Bcl-2、Bax陽性神經細胞數目及Bc1-2/Bax比值均存在非常顯著性差異(P＜0.01)；與模型組相比，高、低劑量組P-Akt(ser 473)、Bcl-2、Bax陽性神經細胞數目及Bc1-2/Bax比值均存在顯著性差異(P＜0.05)，且高、低劑量組間上述指標存在顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

表1 各組大鼠旋轉圈數的比較

組別正常組模型組高劑量組低劑量組14 14 n81 2 FP MDA(nmol/mg)5.31±0.45a 10.62±0.74 7.68±0.30a,b 8.85±0.40a 100.015 0.000 SOD(U/mg)113.82±4.72a 90.29±6.74 102.54±6.71a 95.64±3.05 16.106 0.000 GSH(mg/g)6.98±0.21a 4.20±0.33 5.90±0.31a,b 5.06±0.12a 103.481 0.000

表3 各組大鼠陽性神經細胞數目及Bcl-2/Bax比值比較

3 討論

帕金森病屬于中醫學中“顫病”、“振掉”及“震顫”范疇，帕病1號方源出于《傷寒論》厥陰病主方烏梅丸，方中烏梅以養肝柔筋，熟地黃、山萸肉及何首烏以補益肝腎，當歸及葛根解肌以升津，白芍養血柔筋，全方共奏滋養肝腎、濡養經脈之功。中藥藥理研究表明，何首烏可增加腦勻漿中多巴胺水平，降低帕金森病大鼠左旋多巴誘發的腦內羥自由基的增高[6]。人參皂甙Rg1是人參的提取物，可通過下調核因子-κB信號通路以及Akt和ERK1/2的激活而發揮神經保護機制[7]。另外，當歸、白芍、黃連和甘草中的有效成分均具有抗痙孿和降低肌張力的作用。

神經毒素6-OHDA被廣泛應用體內和體外帕金森病造模。6-OHDA被注射到紋狀體后，黑質神經元發生延遲的退行性變性，持續1～3周。單側紋狀體損毀制備的模型，病理和生化表現與人類帕金森病有很多相似之處，如黑質多巴胺能神經元變性死亡，膠質細胞增生[8]。

阿撲嗎啡誘導的旋轉試驗原理是6-OHDA紋狀體注射后，造成黑質神經元的毀損；此時患側黑質-紋狀體通路多巴胺D-2受體代償性增加，敏感性增高，呈超敏現象[9]，多巴胺受體激動劑阿撲嗎啡可使動物模型向健側產生旋轉行為。阿撲嗎啡誘導后的大鼠旋轉圈數與腦黑質紋狀體系統的損毀程度正相關，因此檢測造模大鼠的旋轉行為可以衡量單側6-OHDA損傷后果[10]。本研究顯示，模型組左側黑質-紋狀體通路受損而致向右側產生旋轉行為，且治療前后旋轉行為無差異，故本實驗帕金森病大鼠模型穩定可靠。予帕病1號方顆粒干預后，高、低劑量組與同期模型組比較，旋轉圈數均出現不同程度減少，提示帕病1號方可以改善6-OHDA對毀損側黑質-紋狀體通路的損傷，且在改善黑質-紋狀體通路的損傷上存在量效關系。

有證據表明，氧化應激反應和自由基損害在帕金森病等神經變性疾病中起重要作用[11-12]。帕金森病患者中腦黑質區存在抗氧化保護系統，如SOD、GSH等功能異常，導致氧化應激反應增強，自由基產生過多，引起蛋白質、脂質過氧化損害、DNA斷裂和神經元凋亡。MDA水平可反映體內脂質過氧化程度，從而間接反映細胞受自由基攻擊的嚴重程度[13]。本研究顯示，6-OHDA模型大鼠左側紋狀體內SOD活性及GSH含量均明顯降低，MDA含量明顯升高，提示帕金森病大鼠模型腦組織中存在明顯的氧化應激反應。高、低劑量組大鼠毀損側紋狀體內SOD活性、GSH及MDA含量與模型組比較均呈現不同程度的差異，尤其是高劑量組差異最為明顯，說明帕病1號方可減輕帕金森病模型大鼠腦內的氧化應激反應，提高抗氧化酶系的活性和清除自由基的能力，且呈一定的量效關系。

多種神經營養因子通過激活Akt信號轉導通路，抑制細胞凋亡，發揮腦保護作用[14]。Akt通過磷酸化抑制凋亡蛋白Bax的活性，上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，從而使得細胞存活。有研究顯示，在帕金森病患者黑質區致密部Akt和P-Akt嚴重衰竭[15]。

Bcl-2家族根據其成員在細胞凋亡中的作用分為兩類：一類為抗凋亡蛋白，包括Bc1-2等；另一類為促凋亡蛋白，包括Bax等[16]。Bcl-2/Bax比值在中樞神經細胞凋亡中起關鍵作用，比值越高，細胞存活率越高；測定Bcl-2/Bax比值有利于判斷是否發生凋亡。本研究顯示，高、低劑量組P-Akt(ser 473)蛋白表達、bcl-2蛋白表達，Bcl-2/Bax比值均不同程度升高，而Bax蛋白表達不同程度下降，說明帕病1號方能激活Akt信號轉導通路，發揮抗細胞凋亡作用，且存在一定量效關系，Akt、Bcl-2和Bax可能是該途徑上起主要作用的靶點。

綜上所述，帕病1號方顆?？赡苤饕ㄟ^減輕帕金森病模型大鼠腦內的氧化應激反應、提高抗氧化酶的活性和清除自由基的能力，同時激活Akt信號轉導通路而共同發揮其對帕金森病模型大鼠的神經保護作用。

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