熱休克處理的腫瘤細胞培養上清對臍血淋巴細胞活性的影響

任林廣，趙珍誼，張 健，徐廣偉，段北野

（1.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012；2.長春百克生物科技股份公司，吉林 長春130012）

腫瘤微環境 （tumor microenvironment）是腫瘤所處的內環境，由腫瘤局部浸潤的免疫細胞、間質細胞及所分泌的活性介質、微血管、組織液等與腫瘤細胞本身共同構成［1，2］。不僅包括腫瘤所在組織的結構、功能和代謝，也與腫瘤細胞自身內環境有關。腫瘤細胞可以通過自分泌和旁分泌，改變和維持自身生存和發展的條件，促進腫瘤的生長和發展。近年來由于腫瘤細胞學和分子生物學的進展，人們對于腫瘤和環境的相互關系有深入了解，認識腫瘤的發生、發展、轉移等有著重要的意義。本研究通過觀察熱休克處理的SMMC－7721細胞培養上清對臍血淋巴細胞表型及殺傷活性的影響，進一步探討腫瘤微環境中某些成分的改變與腫瘤局部浸潤的淋巴細胞之間的關系及其對腫瘤生長的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人臍帶血采自長春市婦產醫院，K562人紅白血病細胞株和SMMC－7721人肝癌細胞株均由本所細胞室提供，人重組干擾素－γ（rIFN－γ）購自長春寶泰克生物科技公司，CFSE（C－1157）購自Molecular Probes公司，PI購自Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 熱休克處理的SMMC－7721細胞上清制備收集處于指數生長期的SMMC－7721細胞，調整細胞密度為2×109/L，接種于培養皿中，6×106個細胞/皿，常規培養48h，更換無血清IMDM，然后將一組培養皿于37℃條件下培養，另一組于42.5℃條件下培養。24h后分別收獲上清，離心（10 000 rpm，10min），分裝，80℃保存備用。用分光光度計測定蛋白濃度。

1.2.2 臍血單個核細胞制備 將采集的臍血用生理鹽水稀釋，疊加到淋巴細胞分離液液面上，離心（2 000rpm，20min），吸取界面層細胞，生理鹽水洗滌2次。用含10%FCS的IMDM培養液重懸細胞，調整細胞密度為3.5×106個/mL。

1.2.3 腫瘤培養上清及細胞因子誘導 將上述制備的臍血單個核細胞接種于6孔板中，3ml/孔，分6組。①IMDM（對照組）；②37℃培養上清 （SN1）；③42.5℃培養上清 （SN2）；④IFN－γ，；⑤SN1＋IFN－γ；⑥SN2＋IFN－γ，每組4復孔。SN1和SN2的終濃度為50μg/ml，IFN－γ終濃度為1 000μg/ml，對照組以等體積IMDM 代之。將培養板置37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養一周。

1.2.4 形態學觀察 將培養板置于倒置顯微鏡下觀察形態學變化并照相。

1.2.5 淋巴細胞亞群檢測 采用流式細胞術，通過四色熒光標記，進行T淋巴細胞亞群的檢測，采用CellQuestPro軟件分析T淋巴細胞群體百分含量。實驗步驟簡述如下：加入熒光抗體CD45//483染液5μl于A管中，CD3/16＋56染液10μl于B管中，向各管內分別加入相對應的細胞樣品，各100μl，充分混勻，20－25℃條件下避光標記15－20min。再向各管內分別加入生理鹽水1ml，震蕩混勻，避光保存。4h內上機檢測。

1.2.6 NK活性檢測 采用CFSE/PI雙熒光染料標記的流式細胞計數法［3］。方法簡述如下：

取處于指數生長期的K562細胞用含10%FCS的IMDM培養液重懸并調整細胞密度為5×105個/ml.加入 CFSE（使終濃度為2.5μmol/L），置37℃孵箱內標記8min。生理鹽水洗滌3次，重懸于10ml含10%FCS的IMDM培養液中，細胞密度為6×104個/ml。將此CFSE標記的K562作為靶細胞加入U型底96孔板中，100μl/孔。收獲前述不同條件誘導的臍血淋巴細胞，調整細胞密度為3×106個/ml作為效應細胞，加入U型底96孔板中，100μl/孔，效靶比50∶1。37℃培養4h。收取各組細胞于相應標號的試管中。取未標記的K562細胞、CFSE標記的K562細胞和對照組效應細胞各少許作為調試電壓的對照。向所有各管中分別加入PI（100μg/ml）25μl。再向各管中補加生理鹽水1 ml，混勻，冰水浴5min，流式細胞儀測樣。收集1000個靶細胞，測量PI和CFSE雙標記細胞的百分比。殺傷活性的計算公式為：

1.3 統計學方法 數據以均數±標準差（±s）表示，采用SPSS16.0統計軟件進行統計學處理。兩樣本均數比較采用t檢驗，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞形態學變化 臍血淋巴細胞在不同培養基中生長一周后，光學顯微鏡下可見，形態有明顯不同。在IMDM培養基中生長良好，可見少許細胞碎片；在含SN1的培養基中細胞生長狀態欠佳，數量減少，碎片增多；當細胞在含SN2的培養基中生長時狀態較好并且可見到很多小細胞。但是當在培養體系中單獨加入IFN－γ后，細胞變大變圓，數量增加。而在IFN－γ培養體系中加入SN1后大圓細胞數量減少但加入SN2時大圓細胞數量又有所增加（圖略）。

2.2 臍血淋巴細胞在不同培養環境中細胞表型及殺傷活性的變化

2.2.1 臍血淋巴細胞表型的變化 臍血淋巴細胞在不同培養環境中培養一周后細胞表型發生改變。表現在：SN1組 CD3＋、CD4＋、CD3－CD16＋CD56＋和CD3＋CD16＋CD56＋四個亞群的細胞百分數與對照組（IMDM）比較沒有明顯差別，CD8＋ 細胞百分數下降（P＜0.05）；SN2組表中五個亞群的細胞百分數與對照組比較均沒有明顯差別，但是CD8＋ 、CD3－CD16＋CD56＋細胞百分數與SN1組比較明顯增加（P＜0.05）；IFNγ組CD3＋、CD4＋細胞百分數與對照組比較明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；而CD3－CD16＋CD56＋細胞百分數明顯增加（P＜0.01）；IFNγ＋SN1組表中前4個亞群細胞百分數與IFNγ組比較均明顯降低（P＜0.05），與對照組比較CD3＋、CD4＋ 、CD8＋細胞百分數也明顯降低（P＜0.01），CD3－CD16＋CD56＋細胞百分數雖然高于對照但無統計學意義；IFNγ＋SN2組與對照組比較CD3＋、CD4＋和CD8＋細胞百分數均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），CD3－CD16＋CD56＋細胞比例明顯增高（P＜0.01），而與IFNγ組比較則只有CD4＋細胞百分數明顯降低（P＜0.05）。與IFNγ＋SN1組比較各亞群均無統計學差異，但是，CD8＋ 和CD3－CD16＋CD56＋細胞比例有所增高。見表1。

表1 臍血淋巴細胞在不同培養環境中細胞表型的變化

2.2.2 臍血淋巴細胞在不同培養環境中細胞殺傷活性的變化 臍血淋巴細胞在不同培養環境中培養一周后，細胞殺傷活性發生明顯改變且與細胞表型改變一致。SN1組NK活性與對照組（IMDM）比較明顯降低（P＜0.05）；SN2組較SN1組活性增強，差異顯著（（P＜0.05）；IFNγ組細胞殺傷活性比較對照組非常顯著提高（P＜0.01）；IFNγ＋ SN1組較IFNγ組明顯降低（P＜0.01）與對照組及SN1組相比無明顯差異；IFNγ＋SN2組殺傷活性低于IFNγ組（P＜0.01），高于IFNγ＋ SN1組（P＜0.05），但與對照組和SN2組比較無明顯差異。見表2。

表2 臍血淋巴細胞在不同培養環境中細胞殺傷活性的變化

3 討論

應激反應能夠啟動熱應激基因的表達，產生一組高度保守的熱應激蛋白（heat shock proteins，HSPs），其中最主要的是HSP70。HSP70按表達情況又可分為結構型HSP70和誘導型HSP70，前者在應激情況下略增加。而后者僅出現于應激細胞，通常在正常細胞中并不表達或表達量很少。但是在應激原的作用下則表達迅速增加，并可釋放到周圍環境中。大量的實驗研究已經充分證明了熱應激處理能夠誘導腫瘤細胞表面表達和釋放 HSP70［4－7］，并且證實了細胞外HSP70能夠激活T輔助細胞，增強淋巴細胞的細胞毒活性［8］。我們的實驗結果表明，42.5℃熱休克處理的SMMC－7721細胞培養上清（SN2）可以使臍血淋巴細胞亞群比例發生改變，表現在CD8＋ 、CD3－CD16＋CD56＋細胞百分數與37℃常規條件下的SMMC－7721培養上清（SN1）組比較明顯增加（P＜0.05），同時，細胞殺傷活性也有改變，SN1組臍血淋巴細胞的殺傷活性較對照組明顯下降（P＜0.05），而SN2組與對照組比較無明顯差別（P＞0.05）但較SN1組明顯增強（P＜0.05）。這一結果進一步證明了熱應激處理后的腫瘤細胞培養上清較常規條件下的腫瘤細胞培養上清對臍血淋巴細胞的抑制作用大大減輕，這可能與熱應激處理后的腫瘤細胞表達和釋放HSP70有關。

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