臍帶源間充質干細胞（hUMSCs）對硫代乙酰胺誘導肝纖維化干預作用的研究

宛 瑩，張世東，賁 亮，劉湘竹，李 超，聶德志＊

（1.四平中心人民醫院中心實驗室，吉林 四平136000；2.吉林省拓華生物科技有限公司，吉林 四平136000）

肝纖維化是多數終末期肝病發展的共同階段，肝臟移植目前被認為是治療肝纖維化的最有效方法之一，但由于肝源供應不足、移植費用昂貴、移植后并發癥嚴重等限制，難以推廣。生物人工肝治療同樣存在異體排斥反應、體外培養細胞受限、解毒有限等問題，不能從根本上解決肝細胞減少的病理生理過程。間充質干細胞作為來自中胚層的一類成體干細胞，在干預肝纖維化過程中取得了一定的成效［1］。本實驗將TAA誘導的肝纖維化小鼠移植hUM－SCs，觀察肝纖維化在移植后的改善作用，旨在為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

雄性Balb/c小鼠，22－24g，購自吉林大學實驗動物中心。所有動物在實驗開始前一周進行實驗環境適應。

TAA購自美國 Sigma公司；CD73，CD90，CD105抗體購自美國BD公司；a－MEM培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自Gibco公司；Masson三染試劑盒購自南京建成生物工程研究所，具體操作遵照說明書。

1.2 實驗方法

1.2.1 hUMSCs的分離、培養及鑒定 足月剖宮產健康胎兒臍帶，經產婦知情同意及醫院倫理委員會批準，取自四平市中心醫院手術室，進行常規分離［2］。選用流式細胞儀分析P5細胞檢測表型。

1.2.2 肝纖維化模型的建立 40只雄性Balb/c小鼠，隨機分成5組即空白組，肝纖維化模型組，hUMSCs移植自身對照組，肝纖維化模型hUMSC移植3天組和7天組。空白組每天經尾靜脈內注射生理鹽水0.1ml/mg，模型組經腹腔注射給予TAA 200mg/kg，每周兩次連續6周后停止給藥，將肝纖維化模型組小鼠頸動脈取血、處死，hUMSCs移植組通過尾靜脈注射hUMSCs 1×106個/0.2ml，分別于注射后的第3天和第7天對小鼠進行處死。

1.2.3 小鼠血清中生化指標測定和病理組織學檢查 小鼠麻醉處死，頸動脈取血并收集肝臟標本。測定血清中ALT和AST的活性。將肝臟組織固定、脫水、石蠟包埋、切片后，進行Masson三染。具體方法參照說明書。

1.2.4 統計學分析 數據以（±s）表示，多組間均數差異性比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA）。數據采用Prism 5.0軟件進行分析。

2 結果

2.1 hUMSCs的分離培養及鑒定

hUMSCs成功從臍帶中分離培養，約6－10天可見hUMSCs細胞從組織塊邊緣爬出。傳至P3時形態學上顯示成纖維細胞形態，細胞呈漩渦樣生長，細胞生長狀態良好。應用流式細胞術對其表型進行分析，表達 CD73，CD90和 CD105；不表達 CD34，CD45，CD14，CD19，HLA－DR。結果顯示分離培養的細胞為hUMSCs（圖1）。

圖1 FACS分析細胞免疫表型

2.2 肝纖維化對小鼠肝重體重的影響

研究表明由TAA誘導肝臟的變化和損傷的程度最初可表現為小鼠體重的變化。由表1可知在TAA連續6周的刺激下，造成模型組小鼠的體重顯著降低，肝重增加。通過移植hUMSCs3天和7天后均可不同程度的維持小鼠的體重在正常水平，降低肝重（P＜0.05）。其中以移植hUMSCs7天后效果更明顯（表1）。

表1 TAA誘導對小鼠體重肝重的影響

2.3 hUMSC移植后對小鼠血清中轉氨酶活性的影響

TAA刺激6周后顯著增加血清中轉氨酶的活性，與正常組比較分別使ALT的水平增加了936%，AST的水平增加了90%。在移植hUMSCs7天和3天后ALT和AST活性降低接近正常。單獨移植hUMSCs組血清中ALT和AST活性與正常組水平接近（圖2）。

2.4 病理組織學Masson染色結果

Masson染色是用于檢測肝臟組織中特異的纖維化變性區域。空白組大鼠可見肝小葉中央靜脈管壁纖維組織染色，匯管區及小葉間隔可見少量纖維沉積；肝纖維化模型組在門靜脈周圍呈現較多的膠原聚集和橋連纖維的形成，與正常組比較形成了較多的纖維性隔膜。hUMSCs移植組膠原的沉積和纖維性隔膜的生成明顯減少。hUMSCs移植自身對照組膠原的聚集與正常組接近（圖3）。

圖2 TAA誘導的肝纖維化在移植hUMSCs后生化指標的變化

圖3 hUMSCs移植后的Masson染色分析（×200）

3 討論

TAA誘導的肝纖維化動物模型在血流動力學、形態學及生化代謝的改變均與人肝纖維化最相似［3－5］，可作用在肝細胞、和蛋白合成酶上產生毒性作用，還可誘導肝的代謝紊亂，甚至肝壞死［6］。本實驗采用TAA連續6周的誘導成功構建了小鼠肝纖維化模型，通過hUMSCs移植后，明顯改善肝功能，使肝臟結構形態恢復至正常水平，提示hUMSCs移植后使肝纖維化的發生進程得到遏制并改善血生化指標和修復損傷的肝臟組織。研究結果顯示hUMSCs移植后7天的抗肝纖維化效果明顯好于移植后3天，這表明采用hUMSCs移植干預肝纖維化的發生與移植后的作用時間存在一定的相關性，對于其能否隨時間延續發生進一步的良性變化還需要繼續觀察，其相關的機制尚待進一步研究。

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［2］野向陽，徐 巖，畢薇薇，等.人臍帶源間充質干細胞體內外移植的免疫學特征［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（45）：8408.

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［5］Shimizu I，Ma YR，Mizobuchi Y，et al.Effects of Sho－saiko－to，a Japanese herbal medicine，on hepatic fibrosis in rats［J］.Hepatology，1999a，30（1）：149.

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