α－enolase在大腸癌與癌旁組織中的表達(dá)及意義

王庭利，劉百歌＊，王玲玲，趙海豐，何成彥，劉 寧，郭宏華

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院；3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院）

大腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，病死率較高。歐美發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，隨著我國經(jīng)濟(jì)社會的快速發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，我國大腸癌發(fā)病率也在不斷提高。因此關(guān)于大腸癌發(fā)生、發(fā)展的研究成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)作為一門新興學(xué)科，在臨床研究中應(yīng)用越來越廣泛。Enolase不僅是一種催化酶，還是一種多功能蛋白質(zhì)，與多種病理生理過程、疾病的發(fā)生發(fā)展有著重要的關(guān)系［1］。近年來，有關(guān)enolase與自身免疫病及腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究逐漸受到重視，但是關(guān)于α－enolase在大腸癌中的研究較少，為此本文應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和免疫蛋白印跡方法研究α－enolase在大腸癌及癌旁組織中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院18例手術(shù)治療的大腸癌患者的腫瘤組織標(biāo)本，均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為Dukes B期及各患者距離腫瘤組織邊緣10cm以外的上端癌旁組織標(biāo)本，術(shù)前均經(jīng)患者同意。患者術(shù)前未接受任何治療，年齡49－78歲，中位年齡57歲，其中男13人，女5人。將所獲得的新鮮標(biāo)本離體后用生理鹽水沖洗干凈后，放入液氮冷凍，－80℃保存。

1.2 主要試劑與儀器

Bio－Rad公司的碘代乙酰胺（IAA）、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、三羥甲基氨基甲烷（Trisbase）、3－［（3－膽酰胺丙基）－二乙胺］－丙磺酸（CHA PS）、碳酸氫氨、苯甲基磺酰氟（PMSF）、Sigma公司的DNA酶和RNA酶、超純水、安捷倫公司的1200納升級液相色譜分析儀和賽默飛世爾公司的LTQXL離子肼質(zhì)譜儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織總蛋白質(zhì)的提取及蛋白濃度分析：對組織標(biāo)本進(jìn)行研磨，裂解，低溫勻漿，離心，將蛋白上清液吸出備用，使用核酸蛋白分析儀檢測后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分析計(jì)算蛋白濃度，分裝，－80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 組織蛋白水解多肽混合物的制備：將提取保存的組織蛋白室溫融化，用25mM NH4HCO3稀釋，使尿素濃度低于2M，加入1M的DTT，充分混勻，使其終濃度為20mM，56℃下還原1h后降至室溫加入1M的碘乙酰胺混勻使其終濃度為50 mM，常溫下避光反應(yīng)30min，按1∶50加入測序級胰酶37℃酶切過夜，酶切后樣品真空抽干后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 液質(zhì)聯(lián)用分析與數(shù)據(jù)庫檢索：將所有樣品用緩沖液A溶解，各取50μg樣本上樣經(jīng)反相色譜洗脫的多肽應(yīng)用LTQXL質(zhì)譜儀檢測，核質(zhì)比檢測范圍為400－2000amu，應(yīng)用數(shù)據(jù)依賴方式進(jìn)行次二級質(zhì)譜掃描。

1.3.4 強(qiáng)度在10個單位以上、有10個以上離子信號的譜圖用SEQ UEST算法和Bioworks3.3.1SP1軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出相關(guān)多肽和蛋白。SEQUEST檢索后篩選參數(shù)如下：1.Rsp＝1；2.在假陽性率為1%時(shí)，DeltaCn≥0.19，Xcorr值在單電荷時(shí)為2.2，雙電荷時(shí)為2.5，三電荷為2.9。

1.3.5 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中每個蛋白的譜圖數(shù)來評價(jià)其豐度。對于在不同樣本中豐度發(fā)生變化的蛋白，其圖譜數(shù)變化必須滿足以下原則：①兩個樣本中圖譜數(shù)的比值大于等于1；②兩個樣本中譜圖數(shù)的差值大于等于72（平均每次實(shí)驗(yàn)差值為24）。每個樣本進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)，然后將大腸癌組織與癌旁組織的蛋白質(zhì)組分析結(jié)果進(jìn)行比較分析，挑選出α－enolase進(jìn)行免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定出大腸癌組織中與癌旁組織中表達(dá)有顯著差異的蛋白，結(jié)果見表1；α－enolase免疫蛋白印跡結(jié)果見圖1；結(jié)果表明，免疫蛋白印跡方法與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：αenolase在大腸癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。

表1 腫瘤組織表達(dá)較癌旁組織高的蛋白

圖1 α－enolase免疫蛋白印跡結(jié)果

3 討論

大腸癌是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤。多年來，很多學(xué)者一直熱衷于大腸癌的病因、發(fā)病機(jī)制、臨床診斷、治療及預(yù)防等方面的研究，闡明大腸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制是其中一項(xiàng)重大課題。大腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因參與、多步驟的復(fù)雜過程，明確其機(jī)制、篩選和鑒定大腸癌生物學(xué)標(biāo)志物成為大腸癌研究的前沿領(lǐng)域和熱點(diǎn)話題。

烯醇化酶是參與糖酵解和糖異生的催化酶，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，也存在于真核細(xì)胞表面和細(xì)胞核中［2，3］。在脊椎動物中，烯醇化酶存在3種亞基：α、β、γ，5種形式的同工酶：αα、ββ、γγ、αβ、αγ；α－enolase存在于大多數(shù)組織，β－enolase幾乎全部存在于骨骼肌中，γ－enolase則主要存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌組織［4，5］。α－enolase以二聚體形式存在，由433個氨基酸組成兩個相同的亞基以反向平行方式結(jié)合而成，每個亞基分子量大約是47KDa。烯醇化酶不僅作為關(guān)鍵酶參與糖代謝過程，α－enolase的N－末端與原癌基因C－myc P2啟動子結(jié)合，負(fù)調(diào)控它的表達(dá)，原癌基因C－myc是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、控制細(xì)胞增殖和分化的一個重要基因，C－myc基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的下調(diào)影響腫瘤細(xì)胞增殖和分化；這表明αenolase參與轉(zhuǎn)錄、凋亡的調(diào)控及細(xì)胞的分化等過程［6］，在一些生物學(xué)與病理生理學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［7］。

目前，烯醇化酶在自身免疫病、肺癌、腦血管及神經(jīng)病變等領(lǐng)域中研究較多，而在在大腸癌方面研究不是很多，涉及到α－enolase與大腸癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。有研究報(bào)道，在術(shù)前血清CEA水平＜5 ng/ml的散在結(jié)直腸癌的患者癌組織中α－enolase的表達(dá)是增加的［8］。也有研究表明，大腸癌的發(fā)生過程中，α－enolase可能是一個核心元素之一［9］。Stierum 等［10］在研究 Caco－2分化 過程中，發(fā)現(xiàn) αenolase表達(dá)增加，表明它與腫瘤的分化有關(guān)。Katayama等［11］對存在中樞轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者的兩種癌細(xì)胞株SW480（原發(fā)病灶）、SW620（轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)）進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)α－enolase在SW620中表達(dá)顯著高于SW480中，提示α－enolase至少部分參與了這兩種癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移過程。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和免疫蛋白印跡方法檢測了α－enolase在大腸癌組織與癌旁組織中的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)α－enolase在大腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，提示α－enolase的高表達(dá)與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。同時(shí)，本研究給我們一個啟示，α－enolase在癌旁組織中的表達(dá)只是相對于癌組織中較低，其在癌旁組織中的表達(dá)與正常組織或炎性組織中表達(dá)的關(guān)系如何，還有待進(jìn)一步研究。國內(nèi)有學(xué)者研究，α－enolase在正常鼻粘膜上皮、癌旁鼻咽上皮和鼻咽癌上皮中表達(dá)情況分別是94.4%、91.7%和52.2%［12］；α－enolase在慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)［13］。國外一項(xiàng)研究顯示抗α－enolase抗體在健康人（4.1%）、肝纖維化患者（21.6%）、肝硬化患者（9.1%）和肝癌患者（14.3%）體內(nèi)的表達(dá)情況是顯著不同的［14］。鑒于α－enolase在大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚不明確，我們需要進(jìn)一步的深入研究。

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