血清非磷酸化MGP蛋白（dpMGP）對強直性脊柱炎的診斷意義

黃漢清，朱立新＊，李留洋，錢 俊，王 坤，曹延林

（南方醫科大學附屬珠江醫院1.骨科；2.腎移植科，廣東 廣州510280）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種以附著點炎及韌帶骨贅形成為主要病理特征的慢性進展性炎性疾病，該疾病最終導致進展性脊柱強直及活動受限［1］。目前多數AS患者確診時，骶髂關節、脊柱已出現骨化、強直，失去了早期治療的機會。同時對于許多患者，服用NSAIDS或TNF拮抗療法雖然可以緩解其疼痛癥狀，改善脊柱活動度，但是TNF拮抗療法并不能阻止AS患者骨結構的破壞包括骨侵蝕及骨贅形成［2］。目前的研究提出假說認為早期診斷和治療可能可以避免最終的骨化進展。

生物標志具有檢測的便利性，尋找一種新的AS疾病的生物標志，以便于強直性脊柱炎的早期診斷，確診，監測AS病理進展，評估治療效果已經成為目前AS研究新方向。

基質 Gla蛋白 （Matrix C－carboxyglutamic acid Protein；Matrix Gla Protein，MGP），是一種分子量為14kD的低分子胞外基質蛋白，因含有5個可羧化γ－谷氨酸殘基而得名，另外還帶有多個可磷酸化的絲氨酸殘基［4］。MGP主要是由軟骨細胞以及血管平滑肌細胞分泌，被證明可以抑制血管鈣化［5］及軟骨成骨分化［6］。MGP的羧化或者磷酸化狀態使得血液中存在多種MGP分子形式，包括磷酸化 MGP［pMGP］，非磷酸化 MGP［dpMGP］，羧化 MGP［cMGP］或者非羧化 MGP［ucMGP］）［7］。

目前尚無AS病人血清或局部組織MGP蛋白水平的大樣本臨床研究，但有研究發現關節炎病人群體（包括5個AS病人）總體表現出關節液與血液中ucMGP的分布異常［8］。AS骨贅形成主要以軟骨化骨的方式進行。目前對MGP蛋白的研究已經揭示MGP蛋白對于異位鈣化以及軟骨化骨的負性調節作用。我們推測MGP可能參與AS病理過程，尤其是骨重建病程。因此監測AS病人dpMGP的血清濃度水平，并研究其與骨重建過程，炎癥的關系，具有研究的必要性。

1 材料與方法

1.1 病人與對照的篩選

該項研究有AS患者82例，對照健康人群75例健康對照人群參與整個橫斷性對照研究過程，已淘汰部分失訪以及資料欠缺的參與者。AS患者及健康對照人群均為2010年1月至2013年1月南方醫科大學附屬珠江醫院的門診及住院的患者（具體納入標準及排除標準見下），或健康查體者。為了減少高齡性心血管鈣化以及骨骼生長發育可能對血清dpMGP蛋白濃度的影響，我們將AS患者及健康對照年齡限制在2060歲以內。AS病人符合修改的紐約診斷標準（1984年）［9］，盡量避免因為 AS病情活動狀態造成的選擇偏倚，排除具有心血管疾病、慢性腎臟疾病、感染、其它風濕性疾病，以及正使用抗腫瘤壞死因子生物制劑、維生素K及其拮抗劑如華法林、維生素D等的患者或者對照人群。

1.2 臨床評估

收集AS病人組及健康對照組臨床資料，包括一般臨床資料（年齡、性別、病程、體重指數（BMI））、CRP濃度（免疫比濁法測定）、ESR（魏氏法）。參照BASDAI（Bath AS Disease Activity Index）評分標準（0－10分）設計隨訪問卷，獲得每個病人 BASDAI［10］評分。

1.3 血清保存及檢測

血樣使用真空非抗凝管收集后在半小時內迅速保存于－20℃，并在1個月內通過離心（2400×g，10 min）獲取上層血清后轉移到－80℃長期保存。

BALP、OC的血清濃度檢測使用ELISA試劑盒操作按照試劑盒（NovaTeinBio，Massachusetts，USA）說明書進行。

我們利用競爭性ELISA試劑盒（Biomedica，Vienna，Austria）檢測dpMGP。單克隆抗體（mAbdpMGP）以MGP的非磷酸化多肽序列SHESMESYELNPF（MGP3－15）為靶點，以 mAb－dpMGP為包被抗體，試劑盒中的微孔板預先已包被該抗體，生物素標記人工合成的dpMGP 3－15多肽序列作為示蹤劑（b－dpMGP3－15），利用單克隆抗體的特異性和生物素－親和系統的放大效應對血清中的dpMGP水平進行檢測。具體檢測過程按照試劑盒說明書進行。

1.4 統計分析

使用SPSS16軟件，組間計量指標差異使用Mann－Whitney U 檢驗，計數指標使用卡方檢驗。通過ROC（receiver operating characteristic）分析確定dpMGP作為AS診斷指標的截斷點，確定在該點的特異性、敏感性、AUC。Spearman秩相關法檢驗dpMGP與各項血清及臨床指標的相關性。P值小于0.01可認為具有顯著性。

2 結果

2.1 AS病人臨床資料

我們對82例AS病人的臨床資料包括年齡、性別比、病程、BMI、HLA－B27陽性率、BASDAI進行統計分析如表1所示。并將患者年齡、性別比、病程、BMI并與75例健康對照比較。我們發現AS組年齡、性別、BMI指標相比對照組差異不具有顯著性（表1）。

表1 AS病人與對照組的各項臨床指標、血清生物標記的比較 （xˉ±s）

2.2 AS病人血清炎癥及骨代謝相關因子濃度水平

AS組比對照組ESR、CRP明顯要高，差異具有顯著性。血清中BALP、OC濃度水平未發現AS組與健康對照具有統計學差異（表1）。

2.3 AS病人血清dpMGP濃度水平及其與年齡的關系

AS組dpMGP濃度低于對照組，P＜0.01。對AS患者按照年齡進行分組，A組（20－40歲），B組（40－60歲）。兩分組的人數相同，其dpMGP值分別為（9.2±2）和（9.0±2.1）nmol/l，兩年齡組之間dpMGP濃度比較，差異不顯著。

2.4 AS血清dpMGP診斷價值

通過ROC曲線分析，獲得dpMGP的最佳截斷點（cutoff point），作為dpMGP診斷AS的界值，為11.5nmol/l，得到最優化的特異性（83%）及敏感性（88%）組合，而此時的AUC（ROC，曲線下面積）為0.81，診斷效力可評為中級。（表2）

表2 血清dpMGP濃度水平對于AS的診斷價值

2.5 血清dpMGP與炎癥及骨重建指標的關聯性分析

將dpMGP濃度與血清指標ESR、CRP、BALP、OC，臨床評分指標BASDAI，進行相關分析。發現dpMGP濃度與ESR、CRP、BALP、OC這些指標關聯性并不具有顯著性。（表3）

表3 dpMGP與臨床評分BASDAI、炎癥及骨代謝生物標記的相關分析

3 討論

3.1 dpMGP蛋白在AS人群中的檢測及其意義

我們首次通過橫斷性對照研究發現AS病人血清dpMGP明顯低于健康對照人群，其均值僅為對照均值的67%。對dpMGP在不同年齡層次患者血清濃度進行分組比較，或者對AS患者dpMGP與年齡之間的關系運用相關分析，其結果都表明年齡并不會對AS患者血清dpMGP濃度造成明顯的影響。到目前為止關于AS病人體內MGP蛋白的研究僅有Silaghi的研究報道有5個AS病人血清uc－MGP低于對照組，但不具有顯著意義，該研究樣本量太少［8］。關于血清中MGP各種羧化或磷酸化分子形式的濃度的研究多見于心血管鈣化、慢性腎衰疾病研究，而且主要是對ucMGP進行研究，的血清有顯著意義。因為ucMGP被認為是血管、動脈瓣鈣化的生物標志［5］。

在我們的研究中首次對血清總dpMGP診斷意義進行了研究。我們發現dpMGP作為診斷指標其特異性及敏感性分別為83%、88%，youden指數為0.56，AUC 為 0.81，其診 斷 價值 可 為 中 級。dpMGP的特異性之所以較低在于目前已知的多種因素如年齡、心血管疾病、慢性腎衰、類風濕，以及維生素K、D等攝入都可能影響MGP及其各種磷酸化及羧化分子形式的濃度［5］。我們的研究在開始階段通過納入標準以排除以上疾病干擾，通過控制研究對象的年齡上限，盡量減少老年性心血管鈣化對MGP濃度的影響。但是上述疾病的早期進展，如動脈、動脈瓣鈣化早期，沒有明顯的癥狀體征，不易鑒別該類病人，難以排除。

到目前為止AS唯一具有較高診斷價值的血液指標是HLA－B27，但是據臨床研究統計其對于診斷HLA－B27陽性的背痛或腰背僵直的病人患有AS的診斷特異性僅為為22.5%［16］。血清dpMGP只需通過ELISA試劑盒即可檢測，較之HLA－B27需應用流式細胞術，成本更低廉，更快速，如果與HLA－B27相結合將極大地提高AS的診斷率。

3.2 dpMGP與強直性脊柱炎炎癥及骨重建生物指標的聯系

為了研究dpMGP跟AS炎癥，骨重建過程，以及疾病活動度的關系，我們對dpMGP與BALP、OC、CRP、ESR、BASDAI進行相關性分析。但是結果未發現血清中反映炎癥的及骨代謝的相關因子CRP、ESR、BALP、OC與dpMGP存在關聯，同樣的結果見于BASDAI。AS病人CRP、ESR、BASDAI是反映AS疾病活動度的指標，BASDAI是評價疾病活動性的金標準。而dpMGP與CRP、ESR、BASDAI的無關聯，反映出其可能與AS活動期聯系并不緊密。

在我們的研究中，雖然BALP、OC與dpMGP無顯著聯系，但是不能藉此否定dpMGP不參與AS的骨化病理，因為BALP、OC雖然是非常好的反映成骨代謝的因子［17］，但是仍然不是反映AS病理骨重建以及骨質改變的敏感指標，到目前為止仍未發現這兩個骨代謝指標與AS的骨代謝過程包括韌帶骨贅，異常骨化，或與此同時存在的骨質疏松存在顯著關聯［18］。

AS骨贅形成主要以軟骨化骨的方式進行。目前對MGP蛋白的研究已經揭示MGP蛋白對于異位鈣化以及軟骨化骨的負性調節作用。我們推測MGP可能參與AS病理過程，尤其是骨重建病程。盡管我們對于dpMGP與BALP、OC的關聯分析沒有發現它們之間的聯系，但是鑒于BALP、OC不是反映AS病理骨重建以及骨質改變的敏感指標，因此選擇其它能夠敏感反映骨重建過程的生物指標，甚至包括影像指標，將是下一步研究的重點。

AS病人血清dpMGP水平低于健康對照人群33%。血清dpMGP指標不容易受年齡因素的干擾，可作為一種新的用于AS診斷的生物標志，其特異性及敏感性分別為83%，88%。

未發現血清dpMGP與AS病人炎癥及骨重建相關指標存在顯著聯系，故仍不清楚dpMGP低濃度水平的機制，及其在AS炎癥及骨重建病程所扮演角色。

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