卡配因參與風心病房顫患者心房纖維化過程

紀 磊，劉盈盈，貢郡利，李樹巖

（1.長春市中心醫院 心內科，吉林 長春130051；2.吉林大學中日聯誼醫院 腎病內科，吉林 長春130033；3.吉林大學第一醫院 心內科，吉林 長春130021）

心房顫動（Atrial fibrillation AF，簡稱房顫）是臨床上最常見而復雜的心律失常之一，研究發現，心房纖維化是房顫患者心房結構重構最主要表現，目前被認為是發生房顫的結構基礎，本研究通過比較風心病永久性房顫、陣發性或持續性房顫與竇性心律患者左心房組織纖維化程度、免疫組化法測卡配因（Calpain I、Calpain II）、caspase－12在左心房組織中的表達并計算其灰度值，闡述其在風心病房顫心房纖維化發生發展中的作用及對房顫發展、維持的影響。為臨床風心病房顫患者心房纖維化及心房結構重構的防治提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

以吉林大學第二醫院及中日聯誼醫院心外科32例風濕性心臟病于2007年6月至2009年1月間行瓣膜置換術的患者為研究對象，其中男11例、女21例，年齡49.81士9.11歲。分為A組：永久性房顫組（Permanent AF組）16例，B組：陣發性或持續性房顫組（Paroxysmal or persistent AF組）10例，C組：竇性心律組（Sinus rhythm組）6例。術前常規行心電圖、超聲心動圖等檢查。所有病例心功能在紐約心臟協會心功能分級（NYHA－C）I－III級標準，心電圖無心肌缺血表現，近期未服用鈣拮抗劑。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 心臟手術中建立體外循環心臟停跳前獲取左心房組織約100mg，除去血液和脂肪組織后置入10%甲醛中固定。

1.2.2 免疫組化方法 采用SP法，心房組織石蠟切片常規脫蠟、水化后，用SP法作免疫組織化學染色。兔抗人calpain I、calpain II抗體為博奧森生物有限公司產品，兔抗人caspase－12抗體為美國Santa Cruz公司產品。

1.2.3 心肌膠原纖維染色 操作方法采用VG染色法，具體方法參見文獻［1］。

1.3 圖像分析

利用MIG2000圖像分析系統，在400倍視野下，calpain I，calpain II，caspase－12免疫組化染色的每張組織切片，隨機選取5個視野，經圖像分析系統記錄灰度值。心肌膠原纖維為鮮紅色，心肌為黃色，細胞核為藍黑或灰色。采用多功能顯微鏡及圖象處理系統（德國Leica）拍照，每張切片選取5個視野，膠原容積積分（collagen volume fraction，CVF）計算方法為每個視野間質纖維化的總面積除以總的結締組織和心肌組織面積之和，取平均值，經圖像分析軟件自動計算。

1.4 統計學分析

所有數據均采用均數±標準差（±s）表示，用SPSS10.0軟件做單因素方差分析，P＜0.05時有統計學意義。兩項指標間的數量關系采用直線相關分析，P＜0.05時有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象一般資料的比較（表1）

表1 研究對象一般資料的比較（±s）

表1 研究對象一般資料的比較（±s）

注：與C組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001；與B組相比，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；＃＃＃P＜0.001。下同

組別 例數（男性/女性） 年齡（歲） 房顫持續時間（月）左心房內徑LAd（mm）左心室射血分數LVEF（%）A組 16（6/10） 50.31±9.09 42.75±22.65＃ 55.58±8.80＊＊＊＃＃ 50.91±5.85＊＊＊＃＃＃B組 10（2/8） 49.90±8.48 13.10±10.88 46.60±5.85＊＊ 59.10±3.78 C組 6（3/3） 48.33±11.59 /35.03±4.65 62.50±6.41

2.2 各組calpain I，calpainII，caspase－12灰度值的 比較 （表2）

表2 calpain I、calpain II、caspase－12表達（灰度值）

2.3 各組膠原容積積分的比較（表3）

表3 膠原容積積分

2.4 直線相關分析 （圖1～4）

2.5 免疫組化結果（圖5～19）

3 討論

Calpain又稱CANP（calcium activated neutral protease），是一種廣泛存在于多種組織和細胞中的鈣離子依賴性半胱氨酸蛋白水解酶，在哺乳動物細胞中廣泛分布，與細胞的凋亡有關［2］。根據激活所需的鈣離子濃度不同，分為μ－calpain（即calpainⅠ）和m－calpain（即calpainⅡ）。二者與其專一抑制劑calpastatin組成鈣蛋白酶系統［3］。在生理狀態下，calpain系統間保持平衡。當細胞內鈣離子濃度增加時，calpain被激活，表達增加，發揮其蛋白水解作用。研究表明，永久性房顫患者心肌肌鈣蛋白T、I、C顯著降解與 活化相關［4］。房顫時伴有心肌細胞內鈣超載。鈣超載可引起內質網應激（ER stress，ERS）。caspase－12是caspase亞家族成員，是ERS介導細胞凋亡調節的一個主要因素，其參與了calpain介導的細胞凋亡。Rammohanv等［5］認為ERS反應時，胞質中的caspase－7自身活化，遷移到內質網膜上，在Asp94和Asp31處切割caspase－12前體，使caspase－12活化?；罨腸aspase－12易位至胞漿中，活化下游的caspase－9，并進一步激活caspase－3，caspase－3通過剪切與 DNA 修復、基因完整性監護有關的底物多聚ADP－核糖聚合酶（PARP），使PARP中與DNA結合的兩個鋅指結構與羧基端的催化區域分離，不能發揮正常功能，導致受PARP負調控影響的Ca2＋/Mg2＋依賴性核酸內切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，導致細胞凋亡。馬驍等［6］在慢性房顫犬心房肌calpain系統表達水平的改變及其與心房重構的相關性的研究中顯示：房顫組心房肌Ca2＋濃度升高，房顫組calpastatin mRNA表達明顯高于對照組（P＜0.05）；房顫組calpainⅠ、calpainⅡ蛋白表達明顯高于對照組（P＜0.05），calpastatin蛋白表達明顯低于對照組（P＜0.05），提示房顫引起calpain系統的蛋白表達改變，使calpain/calpastatin系統相互間作用失衡，造成多種蛋白被降解，導致心房重構。陳運清等［7］研究顯示：永久性房顫時，左心房組織心肌細胞凋亡增加，calpainⅠ、caspase－3與凋亡指數（AI）呈顯著正相關，calpastatin與AI呈顯性負相關。Letavernier等［8］研究表明，calpastatin轉基因小鼠在灌注AngII 4周后血管平滑肌細胞增生程度及左心室肥大程度均不及野生型小鼠，說明calpain的活化參與了AngII引起的左心室肥大及重塑過程，calpastatin作為calpain的內源性專一性抑制劑抑制了AngII引起的左心室重塑過程。新近的研究表明，一種calpain抑制劑N－乙酰－亮氨酸－亮氨酸－蛋氨酸通過凋亡相關蛋白的復雜網絡抑制凋亡，可能改善心房結構重構［9］。

在本研究中，A組calpain I、calpain II灰度值明顯高于B組和C組（P均＜0.001），B組calpain I、calpain II也明顯高于C組（P＜0.001）。上述結果表明風心病心房顫動時心房組織的calpain I、calpain II蛋白激活水平隨房顫的嚴重程度升高。本研究中，A組與B組caspase－12灰度值明顯高于C組（P均＜0.001），而前兩者比較差異無統計學意義；左心房組織中的calpain I、calpain II與caspase－12呈正相關（分別為r＝0.87，P＜0.001，r＝0.88，P＜0.001）（圖1、2）；上述結果說明風心病房顫時由calpain介導的caspase－12活化并表達增多，啟動細胞凋亡程序，引起caspase的級聯反應，導致心肌細胞凋亡，進一步促進心房纖維化的發展及房顫的維持。caspase－12在A組、B組表達無明顯差異及在左房組織心肌細胞上呈點狀分布（圖13－15），其機制尚不明確。本研究中左心房組織中的calpain I、calpain II與CVF呈正相關（分別為r＝0.85，P＜0.001，r＝0.81，P＜0.001），提示calpain I、calpain II通過促進心肌細胞凋亡，使心房實質細胞數目減少，導致心房間質纖維化增多，促進了心房重構及心房纖維化的發展。

隨著對calpain研究的不斷深入，相信在不久的將來用來預防及治療風心病房顫心房纖維化與心房重構的calpain抑制劑能夠應用于臨床，為風心病房顫的防治提供新的策略。

［1］范廣慈，付莉娜，王永軍.風濕性心臟病心房顫動患者心房纖維化程度與心房顫動復發的相關性［J］.新鄉醫學院學報，2008；25（6）：586.

［2］WangKK.Calpain and caspase：can you tell me the difference？［J］.Trends Neuro sci，2000，23（1）：20.

［3］Darrel E G，Valery F，Thompson，Hongqi LI，et al.The Calpain System［J］.J Physiol Rev，2003，83（3）：731.

［4］Ke L，Qi XY，Dijkhuis AJ，et al.Calpain mediates cardiac troponin degradation and contractile dysfunction in atrial fibrillation［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，45（5）：685.

［5］Rammohan V，Rao E，Susana C，et al.Coupling Endoplasmic Reticulum Stress to the Cell Death Program ［J］.Biol Chem，2001，276（8）：33869.

［6］馬 驍，張 薇，鐘 明等.鈣激活蛋白酶系統與慢性房顫犬心房重構關系的研究［J］.中國病理生理雜志，2007，23（10）：1883.

［7］陳運清，王 琳，蘇 晞等.風濕性心房顫動患者calpain－Ⅰ/calpastatin和caspase－3與細胞凋亡的關系及其作用［J］.中華心血管病雜志，2006，34（4）：303.

［8］Emmanuel Letavernier，Jo?lle Perez，Agnès Bellocq，et al.Targeting the Calpain/Calpastatin System as a New Strategy to Prevent Cardiovascular Remodeling in Angiotensin II－Induced Hypertension［J］.Circulation Research，2008，102（6）：720.

［9］Li Y，Gong ZH，Sheng L，et al.Anti－apoptotic effects of a calpain inhibitor on cardiomyocytes in a canine rapid atrial fibrillation model［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2009，23（5）：361.