ELISA法檢測高爾基蛋白73診斷原發性肝癌的方法學評價

袁明生，唐富英，王 影

（1.廣東醫學院附屬陳星海醫院 檢驗科，廣東 中山528415；2.廣東省醫學院附屬陳星海醫院 消化內科，廣東 中山528415）

近年來，基因技術、蛋白質組學、腫瘤免疫等方面的研究飛速發展，發現了一系列新的潛在的腫瘤標志物，高爾基蛋白73（Golgi protein 73，GP73）被認為是最值得期待的肝癌血清標志物之一，GP73診斷原發性肝癌的作用已得到肯定［1－4］。本研究對GP73酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測人血清中GP73濃度的方法學進行了評價，茲報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 ELISA法檢測GP73試劑盒 由北京熱景生物技術有限公司提供，批號：20120101。其原理是雙抗體夾心ELISA法定量檢測血清或血漿樣品中GP73含量：酶標板上預包被抗GP73單抗，可與樣品中GP73反應結合，配合加入HRP標記GP73多抗，然后用TMB底物作用顯色，顯色強度與樣品中GP73濃度成正比。通過酶標儀檢測吸光度（OD值），按照GP73校準品制定濃度曲線（標準品濃度：0ng/ml、70ng/ml、180ng/ml、300ng/ml、500ng/ml），使用線性擬合方式，通過標準曲線計算樣品中GP73的含量。試劑盒有效期為9個月，96人份/盒。

1.1.2 儀器 安圖iWO－960洗板機、安圖2010酶標儀

1.2 方法

1.2.1 GP73測定 血清GP73測定嚴格按試劑說明書操作，安圖2010酶標儀比色，并自動繪制標準曲線，計算出樣品濃度。試劑盒說明書的參考范圍：GP73＜150ng/ml，患肝癌風險率低。

1.2.2 線性范圍 將北京熱景生物技術有限公司提供的 GP73標準液0ng/ml、70ng/ml、180ng/ml、300ng/ml和500ng/ml用此試劑盒按測定方法進行測定，所得結果取吸光度和濃度后用Excel軟件繪制線性圖。

1.2.3 準確度評價 選用四個濃度，連續測5天，根據測定結果與理論值之間的差異來計算偏倚與相對偏倚。偏倚值＝實測濃度－理論濃度；相對偏倚＝｜實測濃度－理論濃度｜/理論濃度×100%。

1.2.4 精密度評價 取兩種濃度的標準品用GP73試劑盒按測定方法測定，連測20天，所取結果計算變異系數（CV）。

1.2.5 回收試驗 選已用本法測定的含量分別為78.9ng/ml和176.1ng/ml血清標本，分別加入等體積的濃度為70ng/ml的標準品，混勻后再用本法進行測定，計算回收率，回收率＝回收濃度/加入濃度×100%。

1.2.6 臨床標本測定 選取我院2010年1月至2012年3月住院病人（排除了其它系統惡性腫瘤和嚴重疾病）共120例，其中肝癌組40例（經住院手術或肝穿病理檢查確診原發性肝癌患者），肝病組40例（慢性肝炎20例、肝硬化20例），對照組40例（門診除孕婦外的健康成年體檢者）。所有肝癌患者和肝硬化患者和對照組人群肘正中靜脈取血于真空管中，靜置30min，在相對離心力3130×g離心5min后，分離后的血清標本放入－20℃冰箱保存待統一檢測GP73濃度。以上所有標本均嚴格按試劑說明書操作測定GP73。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計處理。兩變量間相關性采用Spearman相關分析，一致性采用Kappa，評價診斷實驗的指標用靈敏性、特異性、符合率和陰、陰預測值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 線性范圍

GP73標準液0ng/ml、70ng/ml、180ng/ml、300ng/ml和500ng/ml用此試劑盒按測定方法進行測定，所得結果取吸光度和濃度后繪制標準曲線，縱坐標（Y）為標準濃度，橫坐標（X）為吸光度（OD）值，見圖1。方程為Y＝427.2X－5.05，相關系數（r2）為0.998（P＝0.000）

2.2 準確度

濃度為70ng/ml、180ng/ml、300ng/ml和500 ng/ml的GP73標準液按測定方法進行測定，連測5天，偏倚均＜5ng/ml，相對偏倚均在10%范圍內。見表1。

2.3 精密度

取70ng/ml和180ng/ml濃度的標準品用GP73試劑盒按測定方法各測20次，計算的CV值分別為11.0%和8.9%，均少于15.0%。

圖1 ELISA法GP73標準曲線

表1 GP73試劑盒測定偏倚結果

2.4 回收試驗

選已用本法測定的含量分別為78.9ng/ml和176.1ng/ml血清標本200μl，分別加入等體積的濃度為70ng/ml的標準品，混勻后再用本法進行測定，測量的結果及計算得到的回收率見表2。

表2 回收試驗結果

2.5 方法學比較

以GP73＜150ng/ml作為診斷PHC界點與“金標準”病理結果比較見表3，兩者相關系數（r）＝0.76＞0.5，P＜0.05，兩種方法之間呈正相關性，相關關系較密切，Kappa＝0.533，在0.4～0.75之間，與病理診斷PHC結果有中度的一致性，此時GP73診斷HCC的敏感性為90.0%、特異性為70.0%、符合率為76.70%、陽性預測值為60.0%，陰性預測值為93.3%。

表3 GP73濃度與病理結果比較

3 討論

長期以來，肝癌無創傷的診斷主要是應用血清腫瘤標志物結合影像學的方法。近年來，已有許多報道GP73是新發現的診斷原發性肝癌的的腫瘤標志物［5－6］。GP73是存在于高爾基體的一種跨膜蛋白，Block等［7］于2005年首先提出，在肝癌患者血清中，GP73水平顯著升高。其原因可能與肝癌患者肝細胞損傷有關或是與GP73維持高爾基體結構的完整性有關。細胞器的改變與人類癌的發生聯系密切，當細胞核和線粒體正常功能、結構組成的被破壞時，反映了癌細胞在基因組和微環境上的改變，以適應癌細胞的代謝需求［8］。

由北京熱景生物技術有限公司提供的ELISA法檢測GP73試劑盒的標準曲線有較大的斜率（427.2）和一定的寬度，在0－500ng/ml的范圍內的相關系數為0.998，符合劑量反應工作曲線的要求［9］；在測定范圍內的偏倚均＜5ng/ml，相對偏倚均在10%，有較好的準確度；日間和批間、批內各CV均＜11.0%，少于公認的15.0%，有良好的精密度；此外，還有良好的回收率（97.3%－103.5%），可以根據標準曲線能夠進行定量分析。

本次研究120例臨床標本測量結果與“金標準”病理結果對比研究發現，由北京熱景生物技術有限公司提供的ELISA法檢測GP73試劑盒診斷原發性肝癌的敏感性和特異性分別是90.0%和70.0%，符合率為76.7%。與病理診斷PHC的結果比較，有中度的一致性，其符合率76.7%，雖然陽性預測值只有60.0%，但陰性預測值卻高達93.3%，GP73＜150ng/ml，患PHC的可能性接近5%。有報道［10－12］：GP73用于診斷肝癌效果明顯優于 AFP，可以顯著提高對肝癌診斷的靈敏度和特異性。

綜上所述：GP73試劑盒診斷原發性肝癌的ELISA法既可定量檢測GP73濃度，又操作簡單、重復性好、結果容易判斷、價格低廉，無需特殊儀器和高標準的實驗條件，易于推廣應用；既可作為AFP診斷PHC的補充，又具有獨立檢測價值。

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