當歸多糖對衰老模型小鼠抗氧化作用及p16蛋白表達水平的影響

安方玉，劉雪松，李雪燕，關德鳳，梁健慶，張艷霞

(1.甘肅中醫學院，甘肅 蘭州730000;2.甘肅中醫學院附屬醫院，甘肅蘭州730000)

衰老又叫老化，是隨著年齡增加自身機能減退，結構及組分進行性退變的一種病理現象［1］。機體衰老時，常常會引起細胞增殖功能低下、蛋白酶活性下降等，最終導致臟器萎縮、功能低下［2］。已有研究證實:當歸多糖作為當歸的有效成分之一，具有抗腫瘤、抗炎、增強免疫力、延緩衰老、治療老年癡呆等廣泛藥理作用［3－4］。本研究聯合D－半乳糖和亞硝酸鈉制備小鼠衰老模型，觀察小鼠腦組織中p16蛋白的表達、單胺氧化酶(MAO)的活性變化，肝組織及腎組織中MAO和過氧化氫酶(CAT)的活性變化，以期為當歸延緩衰老提供理論和實驗依據，并為中藥治療老年病的研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 動 物

清潔級昆明種小鼠60只，雌雄各半，體質量(20±2)g，由甘肅中醫學院科研動物中心提供，動物質量合格證號:SCXK(甘)2011－0001－0001126。

1.2 藥品、試劑與儀器

當歸多糖，陜西慈緣生物技術有限公司產品，批號CY110320，用生理鹽水配制成10 g/L的儲備液，備用。D－半乳糖，北京化學試劑公司產品，批號020123，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L備用;亞硝酸鈉，西安化學試劑廠產品，批號860723，臨用前用生理鹽水配制成9 g/L備用;MAO測定試劑盒(批號20120715)、CAT試劑盒(批號20120725)、考馬斯亮藍測定試劑盒(批號20120816)，均由南京建成生物工程研究所提供;p16 ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司產品，批號20120825。SK3300H型數控超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司產品;VIS－723N型紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司產品;BS224S型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品;HH－4數顯恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠產品;XYJ80－20型離心機，金壇市恒豐儀器廠產品;XW－80A型旋渦混勻器，上海精科實業有限公司產品;ZY12306型微量加樣器，德國BRAND公司產品;DG3022型酶聯免疫檢測儀，華東電子管廠產品。

1.3 動物分組、給藥與模型的建立

將60只小鼠按照隨機數字表法隨機分為空白對照組，模型對照組，當歸多糖低、中、高劑量組，腦復康組6組，每組10只。采用灌胃給藥法，當歸多糖高、中、低劑量組分別按照 400，200，100 μg/g 劑量給藥［4］，腦復康組按照 200 μg/g劑量給藥，模型對照組及空白對照組灌服等體積的生理鹽水。給藥同時，模型對照組，當歸多糖高、中、低劑量組，腦復康組每日腹腔注射D－半乳糖120 μg/g和亞硝酸鈉 90 μg/g 各 0.2 mL［4－5］，空白對照組腹腔注射等體積的生理鹽水，治療8周。

1.4 檢測指標

8周后，眼球采血處死小鼠，取其大腦、肝、腎組織用冷生理鹽水沖洗后備用。

1.4.1 腦組織生化指標

用電子天平稱量腦組織，用生理鹽水按1∶9的比例稀釋成100 g/L腦勻漿，采用普通離心法，3 000 r/min離心10 min，以微量加樣槍吸取上清液待用。利用芐胺作為底物，在MAO作用下，生成產物芐醛，用環己烷提取，測定242 nm處的吸光度值，計算MAO的活力。酶蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法。p16蛋白含量的測定采用ELISA檢測法。操作步驟按照試劑盒的操作說明執行。

1.4.2 肝組織生化指標

用電子天平稱量肝組織，用生理鹽水按照1∶9的比例稀釋成100 g/L肝勻漿，采用普通離心法，3 000 r/min離心10 min，以微量加樣器吸取上清液待用。MAO活力的測定方法同1.4.1。利用 CAT在一定條件下可以分解底物過氧化氫(H2O2)，使H2O2在反應體系中的濃度逐漸降低，吸光度也逐漸降低，利用紫外分光光度法在240 nm處測定OD1和OD2值，計算出CAT的活力。酶蛋白含量的測定方法同1.4.1。操作步驟按照試劑盒的操作說明執行。

1.4.3 腎組織生化指標

用電子天平稱量腎組織，用生理鹽水按照1∶9的比例稀釋成100 g/L腎勻漿，采用普通離心法，3 000 r/min離心10 min，以微量加樣器吸取上清液待用。MAO活力的測定方法、酶蛋白含量的測定方法同1.4.1。CAT 活力的測定方法同 1.4.2。操作步驟按照試劑盒的操作說明執行。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠腦組織p16蛋白表達對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠腦組織p16蛋白表達增加，差別有統計學意義(P＜0.01)。當歸多糖各劑量組腦組織p16蛋白的表達較模型對照組降低，以中、高劑量組明顯，差別有統計學意義(P ＜0.05或 P＜0.01);但與腦復康組對比，差別無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腦組織p16蛋白表達對比 ±s

表1 各組小鼠腦組織p16蛋白表達對比 ±s

注:與空白對照組對比，＊＊P＜0.01;與模型對照組對比，#P＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 動物數 劑量/(μg·g－1) p16/(μg·L－1)10 4.12 ±0.56模型對照組 10 7.91 ±0.60＊＊腦復康組 10 200 5.12 ±0.53##當歸多糖低劑量組 10 100 7.09 ±0.31#當歸多糖中劑量組 10 200 5.82 ±0.59##當歸多糖高劑量組 10 400 4.71 ±0.62空白對照組##

2.2 各組小鼠腦組織MAO活性對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠腦組織MAO的活性升高，差別有統計學意義(P＜0.01)。當歸多糖各劑量組腦組織MAO活性較模型對照組下降，以中、高劑量組明顯，差別有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01);但與腦復康組對比，差別無統計學意義(P ＞0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腦組織MAO活性對比 ±s

表2 各組小鼠腦組織MAO活性對比 ±s

注:與空白對照組對比，＊＊P ＜0.01;與模型對照組對比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 動物數 劑量/(μg·g－1) MAO/(U·mgprot－1)10 6.34 ±1.10模型對照組 10 8.32 ±2.45＊＊腦復康組 10 200 3.34 ±0.34##當歸多糖低劑量組 10 100 6.70 ±0.71#當歸多糖中劑量組 10 200 3.61±0.86＊＊##當歸多糖高劑量組 10 400 2.19 ±2.01＊＊##空白對照組

2.3 各組小鼠肝組織MAO活性和CAT活性對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠肝組織MAO活性升高、CAT活性下降，差別有統計學意義(P＜0.01)。當歸多糖各劑量組與模型對照組對比，肝組織MAO的活性雖降低但差別無統計學意義(P＞0.05)、CAT活性升高且差別有統計學意義(P ＜0.05或 P＜0.01);但與腦復康組對比，差別無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 各組小鼠肝組織MAO活性和CAT活性對比 ±s

表3 各組小鼠肝組織MAO活性和CAT活性對比 ±s

注:與空白對照組對比，＊＊ P ＜0.01;與模型對照組對比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 動物數 劑量/(μg·g－1) MAO/(U·mgprot－1) CAT/(U·gprot－1)6.17 ±1.01 363.54.74 ±89.30模型對照組 10 10.26±2.04＊＊ 175.02±55.94＊＊腦復康組 10 200 8.34 ±1.31 309.74 ±25.93##當歸多糖低劑量組 10 100 9.92 ±2.53 234.35 ±25.89＊＊#當歸多糖中劑量組 10 200 8.78 ±1.37 278.75 ±47.73＊＊##當歸多糖高劑量組 10 400 7.19 ±2.21 347.94 ±41.21空白對照組10##

2.4 各組小鼠腎組織MAO活性及CAT活性對比

與空白對照組對比，模型對照組小鼠腎組織MAO活性升高、CAT活性下降，差別有統計學意義(P＜0.01)。與模型對照組對比，當歸多糖各劑量組使腎組織MAO活性明顯降低、CAT活性明顯升高，以中、高劑量組最為明顯，差別有統計學意義(P＜0.05或 P＜0.01);與腦復康組對比，差別無統計學意義(P ＞0.05)。見表4。

表4 各組小鼠腎組織MAO活性和CAT活性對比 ±s

表4 各組小鼠腎組織MAO活性和CAT活性對比 ±s

注:與空白對照組對比，＊＊P ＜0.01;與模型對照組對比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 動物數 劑量/(μg·g－1) MAO/(U·mgprot－1) CAT/(U·gprot－1)10 10.93 ±1.49 340.99 ±70.73模型對照組 10 15.54±1.98＊＊ 163.49±52.01＊＊腦復康組 10 200 10.07 ±1.45## 284.25 ±30.19##當歸多糖低劑量組 10 100 12.13 ±2.18# 240.30 ±46.44＊＊#當歸多糖中劑量組 10 200 10.41 ±1.54## 278.23 ±42.49＊＊##當歸多糖高劑量組 10 400 9.68 ±2.62## 297.94 ±29.10*##空白對照組

3 討論

細胞衰老是生物體衰老的基本單元，也是各種老年病的發病基礎。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，衰老機制的研究日趨深入，特別是衰老過程中p16基因的表達受到廣泛關注。p16基因是一種細胞周期負調控因子，在人類細胞衰老過程中持續高表達［6］。金建生等［7］報道:將 WI-38 細胞從第24代開始與不同濃度的人參皂苷Rg1共同培養后，p16、CyclinD1表達水平降低，CDK4表達水平增加，說明Rg1延緩衰老的機制可能是改變細胞周期調控因子的表達而實現的。Duan等［8］以p16基因正反義載體分別轉染年輕的人成纖維細胞，發現p16基因mRNA高表達導致細胞早衰，而其反義載體轉染通過抑制p16基因mRNA表達可以延緩細胞衰老。韓旭等［9］研究也證實:參黃沖劑可有效改善衰老患者的臨床癥狀，提高日常生活能力，提高血清NO含量和SOD活性，減少p16基因mRNA的表達，提示參黃沖劑抗衰老的機制是通過抑制衰老細胞增殖而實現的。本研究結果也顯示:模型對照組小鼠腦組織p16蛋白的表達量增加(P＜0.01);給予當歸多糖干預后，小鼠腦p16蛋白的表達降低，差別有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。提示當歸多糖具有抑制衰老細胞增殖的作用。

有研究證實:體內代謝或外源性因素產生的自由基可誘導細胞凋亡［10］。自由基是指在最外層軌道中含有未配對電子的原子、原子團或特殊狀態的分子。機體在正常情況下通過酶類和非酶類防御系統清除自身產生的自由基。但是，隨著年齡的增長，機體抗氧化酶的活性逐漸下降，清除自由基的能力不斷下降，導致機體氧自由基發生蓄積中毒;同時，這些氧自由基與核酸、蛋白質、氨基酸、脂質等反應，促進了機體的衰老［11］。其中MAO和CAT是研究衰老的重要指標之一。許多研究證明，MAO活性隨年齡增加［12］，CAT 活性隨年齡降低［13］。本研究結果也證實:模型對照組小鼠MAO活性升高，CAT活性降低(P＜0.01);給予當歸多糖干預后，小鼠腦組織和腎組織MAO活性明顯降低、肝組織和腎組織CAT活性明顯增強，差別有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。提示當歸多糖具有抗氧化作用。

綜上所述:當歸多糖具有延緩衰老的作用，其機制可能與提高機體抗氧化能力和下調衰老相關基因p16的過度表達有關。

［1］鄒承魯.當代生物學［M］.北京:中國致公出版社，2000:394－396.

［2］童坦君，張宗玉.衰老機制及其學說［J］.生理科學進展，2007，38(1):14 －18.

［3］胡小平，李玉云，李先何，等.當歸多糖的成分及藥理學研究新進展［J］.中藥材，2004，27(1):70 －72.

［4］徐露，董志.當歸多糖抗衰老的實驗研究［J］.激光雜志，2008，29(4):89 －90.

［5］張妍.復方丹參對早老性癡呆動物的作用及機制研究［D］.北京:北京中醫藥大學，2008.

［6］李堅，王艾琳，孟繁軍.細胞衰老與凋亡關系的研究［J］.北京大學學報:自然科學版，2005，6(1):43－46.

［7］金建生，趙朝暉，陳曉春，等.人參皂苷Rg1延緩衰老作用可能與改變p16、cyclinD、CDK4的表達有關［J］.中國臨床藥理學與治療學，2004，9(1):29－34.

［8］Duan J，Zhang Z，Tong T.Senescence delay of human diploid fibroblast induced by anti－ sense p16INK4α expression［J］.J Biol Chem，2001，276:48325.

［9］韓旭，李七一，郭宏敏，等.參黃沖劑對衰老患者抗氧化作用及p16基因mRNA表達的影響［J］.中國中醫藥信息雜志，2011，18(11):11 －14.

［10］Buttke TM ，Sandstrom PA Oxidative Stress as a mediator of apoptosis［J］.Immunol Today，1994，15(1):7 －10.

［11］張萌，廉潔.復方地黃對老年性癡呆大鼠的行為學及腦內SOD、MAO的活性影響的實驗研究［J］.中國醫藥導報，2011，8(7):50 －52.

［12］張大偉，李楠，庾英蘭，等.丹參注射液對老齡小鼠心、腦、肝臟MAO活性的影響［J］.黑龍江醫藥科學，2011，34(4):56－57.

［13］王嵐，梁日新，楊濱，等.黃芩及紅花水提物對快速老化模型小鼠的抗衰老作用研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16(13):159 －162.