血塞通對局灶性腦梗死大鼠海馬Nogo-A表達的影響*

吳建華 張曉倩 朱陵群

（北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部重點實驗室 北京市重點實驗室，北京 100070）

成人的中樞神經系統的再生能力微乎其微，主要的影響因素之一就是中樞神經系統微環境中存在著眾多的抑制性因子。在已知的諸多抑制因素中Nogo-A是最主要的中樞神經軸突生長抑制因子［1］。中藥血塞通在缺血性腦血管病的治療中具有很好的療效，本研究通過觀察大鼠大腦中動脈阻塞模型不同恢復時間點大腦海馬區病理學改變以及Nogo-A蛋白含量的變化，探討藥物血塞通對腦缺血后中樞神經的保護、功能重建的作用機理以及血塞通不同劑量應用所產生的不同療效。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠，體質量（300±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK（京）2006-0009。

1.2 藥物與試劑 尼莫地平片（拜耳醫藥保健有限公司生產，國藥準字 H20003010），規格：每片 30 mg；注射用血塞通凍干粉（昆明制藥集團股份有限公司生產，國藥準字Z20026438），主要成分為三七總皂苷，規格：每瓶400 mg。2636型尼龍栓線：線身直徑0.25 mm，線頭直徑（0.34±0.02）mm，線長 40 mm，購自北京沙東生物技術有限公司。Nogo-A為兔多克隆抗體（美國santa cruz公司，批號：sc-25660），SP 試劑盒、DAB 顯色試劑盒均購自北京百事創新科技有限公司。

1.3 MCAO模型制備 大鼠編號稱體質量后隨機分為手術組和非手術組（正常組）。手術組動物參考文獻采用改良的EZ Longa方法［1］制備大鼠MCAO模型。術前12 h禁食不禁水，腹腔注射3.5％水合氯醛麻醉（10 mL/kg），仰臥位固定，于頸正中縱行切開皮膚，鈍性分離頸部肌群，游離頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）與頸內動脈（ICA），結扎ECA近分叉處和CCA近心端，用動脈夾暫時夾閉CCA遠端，在CCA結扎與夾閉兩處之間用虹膜剪剪開一小口，將浸于肝素生理鹽水中的尼龍線栓沿CCA插入ICA，并順ICA推進18~22 mm，稍遇阻力停止，即可造成大腦中動脈的阻斷，然后結扎頸總動脈固定栓線，縫合皮膚，放到籠中并保暖。MCAO模型成功的判斷標準采用Longa EZ評分標準［1］：0 分，無神經缺損表現；1 分，對側前爪不能充分伸展；2分，向外側轉圈；3分，行走時向對側傾倒；4分，不能行走，意識喪失。動物清醒后進行神經功能評分，1至3分者為納入標準，0分和4分者剔除。

1.4 分組及給藥 所有納入實驗的動物，根據Longa評分和體質量隨機分組，分為模型組，血塞通大劑量組，血塞通小劑量組和尼莫地平組以及未手術的正常組5組。給藥劑量按大鼠與人的體表面積等效劑量折算，尼莫地平片每日為1.44 mg/100 g；血塞通小劑量每日為3.6 mg/100 g；血塞通大劑量每日為7.2 mg/100 g。各組大鼠均于當日手術后5 h給藥，血塞通大、小劑量組進行腹腔注射，尼莫地平組予以尼莫地平混懸液灌胃，模型組和正常組每日腹腔注射等體積生理鹽水，藥物每日新鮮配制，各組大鼠每3日稱1次體質量，根據體質量重新計算每只動物的給藥量，直到取材當日處死時。

1.5 標本采集與檢測 于術后第7、14、28日3個時間點分別進行取材。（1）蘇木素-伊紅（HE）染色。在各時間點，每組大鼠用腹腔注射3.5％水合氯醛麻醉后，使用PBS和4％多聚甲醛心臟灌注，然后將大鼠快速斷頭處死，冰上取腦，4％多聚甲醛浸泡固定，視交叉后2 mm取腦組織，常規脫水浸蠟包埋，行5 μm厚度切片。每只大鼠取1張含有海馬區的切片，切片脫蠟至水，進行常規HE染色。（2）免疫組化染色。石蠟切片常規脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液修復、3％過氧化氫避光浸泡。4℃孵育滴加兔抗Nogo A多克隆抗體（1∶25）至少16 h。生物素標記二抗，37℃孵育30 min，使用PBS緩沖液清洗數次，滴加辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素工作液后，孵育時間與溫度與二抗相同。然后在室溫下滴加DAB顯色劑避光顯色，顯色完畢后自來水終止顯色。常規脫水中性樹脂透明封片。以0.01 mol/L PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。（3）圖像與數據分析。使用OLYMPUS BX60型顯微鏡和SPOT-Ⅱ軟件進行圖像采集，用Meta Morph Universal imaging corporation軟件進行圖像分析。各組各時間點的免疫組織化學圖像分析采用陽性信號光密度值作為參數進行統計分析。

1.6 統計學處理 數據經正態分布及方差齊性檢驗后進行方差分析，應用SPSS10統計軟件，數據以（±s）表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術后不同時間點各組大鼠神經功能評分 見表1。模型組術后5 h神經功能缺損嚴重，評分較高，術后48 h缺損的神經功能有所恢復，評分開始下降，術后72 h評分，模型組顯著高于尼莫地平組和血塞通各組（P＜0.05 或 0.01）。

2.2 一般狀態 正常組SD大鼠活動靈活，精神狀態良好。術后24 h內各組大鼠活動度較差，皮毛不光澤，反應遲鈍，蜷縮聚集，飲食飲水受限，24 h后，手術各組大鼠開始飲食飲水，但精神、反應和活動度仍然較差。術后7 d各組大鼠精神、反應及活動度有好轉，血塞通組和尼莫地平組較模型組好轉明顯，能自由活動。術后14 d各組大鼠恢復很快，飲食飲水正常，活動度較好。術后28 d，各組動物一般狀態接近正常，活動度跟正常動物無明顯的差異。正常組的動物精神狀態，活動度，飲食飲水一直很好。

2.3 形態學觀察 HE染色正常組大鼠海馬區內的神經元數量較多，且排列整齊，細胞結構完整，細胞體積大，核大而圓，核仁明顯；而模型組大鼠海馬區神經元排列紊亂，界限不清楚，神經元之間間隙增大，正常細胞結構消失，較多神經元呈固縮狀壞死。與模型組相比，血塞通大小劑量組和尼莫地平組病理形態變化得到一定程度的改善，海馬神經元排列較整齊，細胞結構較完整，固縮的神經元數量較少，且血塞通大劑量組較小劑量組的病理形態變化改善明顯。

2.4 MCAO術后大鼠海馬Nogo-A蛋白表達的變化見表2。模型組在MCAO 術后7、14、28 d的海馬Nogo-A的表達持續增高，均顯著高于正常組，具有非常明顯差異（P＜0.01）。各藥物組Nogo-A的表達均低于模型組，其中血塞通大劑量組、尼莫地平組在給藥后7、14、28 d的海馬Nogo-A 的表達均顯著低于模型組，具有明顯差異（P＜0.01）；血塞通小劑量組海馬的No-go-A的表達在給藥后28 d顯著低于模型組，具有顯著差異（P＜0.05）；血塞通大劑量組的Nogo-A的表達在28 d明顯低于血塞通小劑量組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經功能評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經功能評分比較（分，±s）

與模型組同時間點比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別 n尼莫地平組 21正常組 7模型組 18術后5 h 術后24 h 術后48 h 術后72 h 2.05±0.6 1.76±0.44 1.67±0.48 1.28±0.46**0 0 0 0 2.00±0.59 1.89±0.58 1.83±0.51 1.78±0.43血塞通大劑量組 18 2.11±0.47 1.78±0.55 1.67±0.59 1.38±0.50**血塞通小劑量組 18 2.06±0.54 1.83±0.38 1.77±0.42 1.33±0.48*

表2 各組大鼠海馬Nogo-A蛋白表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠海馬Nogo-A蛋白表達水平比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較，△△P＜0.01。

組 別 n尼莫地平組 8正常組 8模型組 8 7 d 14 d 28 d 0.149±0.019** 0.167±0.014**△△ 0.196±0.016**△△0.147±0.013**0.153±0.016** 0.156±0.019**0.179±0.015△△ 0.201±0.020△△ 0.239±0.018△△血塞通大劑量組 8 0.152±0.013** 0.179±0.013**△△ 0.204±0.015**△△血塞通小劑量組 8 0.161±0.014 0.187±0.012△△ 0.215±0.017*△△

3 討論

缺血性腦血管病后，中樞神經功能的重建一直是影響腦科學領域發展的最重要的問題之一。原因在于中樞神經系統的環境中既存在著營養因子，又存在著阻止神經的抑制因子。近年來研究已經證實在中樞神經功能的重建過程中存在著多種神經生長抑制因子，其中Nogo-A具有很強的軸突生長抑制作用，被認為是阻止中樞神經再生的關鍵因素［2-3］。Nogo-A由少突膠質細胞表達的整合膜蛋白，在成年哺乳動物中主要存在與中樞神經系統［4］。早在80年代，已經有學者開始陸續發現動物體內的相關蛋白，但直到2000年，由Chen、Prlnjh 等人了首先克隆出了 Nogo 基因［5］。該基因的發現對于缺血性腦血管病的治療具有重要意義。在近年來的缺血性腦疾病的研究中，如何通過藥物、基因以及生物學手段，解除該基因的抑制作用，成為缺血性腦疾病后促進軸突生長和重塑神經功能的熱點方向。

本實驗的線栓法大鼠中動脈阻塞（MCAO）模型目前應用最廣泛，多年來，國內外研究者對其進行了很多研究、改進，使其成為一種比較穩定、可靠、能反映人類腦缺血疾病的動物模型。該模型相比開顱操作等其他方法具有創傷小，操作簡便的優勢，但是模型的最關鍵步驟是在非直視情況下完成的，因為對于實驗材料的選擇具有較高的要求。其中最關鍵的因素為動物的體重選擇與線栓的插入尺寸。目前報道300g左右的大鼠應使用直徑0.25 mm的插線，自頸總動脈分叉處插入18±5 mm［6-7］。

血塞通主要成分為三七總皂苷，中藥三七活血化瘀、化瘀而不傷正氣。血塞通對脊髓損傷、腦出血、腦缺血后受損神經元有保護作用，已經在臨床廣泛應用［7-8］。本實驗結果顯示，血塞通組在術后的精神狀態、活動度均較同時間點模型組有所改善，在從恢復時間上更快，而且術后腦部梗死范圍較小，組織結構更完整，提示了血塞通對于大鼠腦缺血后對腦組織具有更好的保護作用；模型組7、14、28 d的海馬Nogo-A的表達持續增高，均顯著高于正常組，而各藥物組Nogo-A的表達均低于模型組，其中血塞通大劑量組、尼莫地平組在給藥后7、14、28 d的海馬Nogo-A的表達均顯著低于模型組具有非常顯著性差異，提示Nogo-A可能在腦缺血早期即發揮其抑制軸突再生的作用，而其長時間的高水平表達可能是腦損傷后神經元再生困難的原因之一，而血塞通可以下調Nogo-A的表達，這可能是血塞通能夠促進腦梗死后神經功能恢復的原因之一。而且血塞通大劑量組在降低Nogo-A基因表達方面具有更明顯的作用。根據實驗結果可以看出，血塞通在術后促進細胞生長、組織結構重建以及腦功能恢復方面具有較好的效果，為今后的臨床應用提供實驗依據。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et，al.Reversible middle cerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［2］Pernet V，Schwab ME.The role of Nogo-A in axonal plasticity，regrowth and repair［J］.Cell Tissue Res，2012，349（1）：97-104.

［3］Wang T，Xiong JQ，Ren XB，et，al.The role of Nogo-A in neuroregeneration：a review［J］.Brain Res Bull，2012，87（6）：499-503.

［4］楊曉梅，周長滿.Nogo-A蛋白的研究進展［J］.神經解剖學雜志，2004，20（3）：319-321.

［5］Chen MS，Huber AB，Vanderhaar ME，et al.Nogo-A is a myelin-associat ed neurit e out growthinhibitor and anantigen for monoclonal antibody IN-1［J］.Nature，2000，403（6768）：434.

［6］劉玉和，于春榮.線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的研究［J］.北華大學學報：自然科學版，2007，8（1）：41-45.

［7］王席玲，鄒憶懷，翟建英，等.三七三醇皂苷對MCAO大鼠BDNF和TrkB表達的影響［J］.北京中醫藥大學學報，2008，31（2）：102-105.

［8］楊挺，蔣贊利，茅祖斌.血塞通在中樞神經系統疾病中的應用［J］.現代醫學，2010，38（1）：86-89.