復(fù)方清熱顆粒對(duì)鮑氏不動(dòng)桿菌外排泵影響的實(shí)驗(yàn)研究*

楊鳳春 任愛民 王 紅 張淑文

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050）

鮑氏不動(dòng)桿菌屬于條件致病菌，是目前醫(yī)院感染的重要病原菌之一，成為僅次于銅綠假單胞菌的第2位非發(fā)酵菌［1-2］。多項(xiàng)研究［2-4］表明復(fù)方清熱顆粒具有抗菌活性，可以改善細(xì)菌的耐藥性。本實(shí)驗(yàn)從中藥復(fù)方清熱顆粒入手，觀察其對(duì)鮑氏不動(dòng)桿菌的耐藥性的影響，以探討復(fù)方清熱顆粒能否改善外排泵陽(yáng)性鮑氏不動(dòng)桿菌的耐藥情況。

1 材料

1.1 動(dòng)物及菌株 健康大耳白兔，體質(zhì)量1.8~2.5 kg，購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，監(jiān)測(cè)并記錄心率、呼吸頻率、肛溫、體質(zhì)量及攝食情況。實(shí)驗(yàn)菌株為2012年3月至2012年9月北京友誼醫(yī)院住院患者分離的鮑氏不動(dòng)桿菌，所有菌株均經(jīng)法國(guó)生物梅里埃VITEK全自動(dòng)微生物系統(tǒng)鑒定。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，北京友誼醫(yī)院檢驗(yàn)中心保存菌株。

1.2 藥物和試劑 環(huán)丙沙星（CIP）購(gòu)自上海董李貿(mào)易有限公司，批號(hào)：85721-33-1，純度≥98％；西黃耆膠，購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；復(fù)方清熱顆粒，由蒲公英、敗醬草、虎杖、半枝蓮、大黃、黃芪組成，購(gòu)自北京康仁堂藥業(yè)有限公司；碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙（CCCP）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；血瓊脂培養(yǎng)皿購(gòu)自天津金章科技發(fā)展有限公司；M-H瓊脂粉購(gòu)自BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 電熱恒溫培養(yǎng)箱 DH6000AB型，天津市泰斯特儀器有限公司。光電比濁儀，法國(guó)，生物－梅里埃公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)以（±s）表示。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布者，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，兩組間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 方法與結(jié)果

2.1 含藥血清的制備 將14只大耳白兔隨機(jī)分為兩組，模型組8只，對(duì)照組6只。禁食12h，模型組給予腹腔注射多重耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌菌液，注射劑量2.5×109/kg，12 h后測(cè)肛溫、血常規(guī)，體溫＞39.5℃、白細(xì)胞總數(shù)＞13×109/L者入選，模型組有6只白兔符合上述標(biāo)準(zhǔn)而入選。造模成功后分別記錄模型組及對(duì)照組大耳白兔的心率（HR）、呼吸頻率（R）、肛溫（T）、體質(zhì)量（W）及攝食情況。模型組于造模成功后第2日開始給予復(fù)方清熱顆粒劑藥液灌胃，每日 2 次，劑量為 22 g/（kg·d），連續(xù)給藥5 d。對(duì)照組給予同等體積的蒸餾水灌胃，同樣是每日2次，連續(xù)5 d。治療期間監(jiān)測(cè)并記錄兩組大耳白兔的心率、呼吸頻率、肛溫、體重及攝食情況，同時(shí)各組大耳白兔每日均正常飼料喂養(yǎng)，治療結(jié)束后禁食12 h，無(wú)菌心臟采血，4000 r/min離心10 min，分離出含藥血清和空白血清后同組混和，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鹘M治療前后R，HR，T，W的變化見表1。

2.2 CCCP工作濃度的確定 準(zhǔn)確稱取CCCP粉劑，先用少量DMSO溶解，然后再加無(wú)菌蒸餾水至所需體積。分別配制 2000、1000、500、200、100、50 μg/mL 的CCCP溶液，過(guò)濾除菌備用。于每個(gè)平板（直徑90 mm）中對(duì)應(yīng)加入上述CCCP溶液2 mL和已消毒并冷卻至50℃左右的MH培養(yǎng)基18 mL，充分混勻，配成分別含有終濃度為 200、100、50、20、10、5 μg/mL 的含 CCCP瓊脂平板，將32株臨床分離的耐環(huán)丙沙星鮑氏不動(dòng)桿菌分別劃線接種于上述配制好的瓊脂平板，同時(shí)接種不含CCCP的瓊脂平板做對(duì)照，接種量為1×105CFU/mL，接種完畢后置36℃恒溫箱中培養(yǎng)20 h，觀察結(jié)果。在CCCP終濃度為200 μg/mL時(shí)，無(wú)菌株生長(zhǎng)；在CCCP終濃度為100 μg/mL時(shí)，有16株鮑氏不動(dòng)桿菌不生長(zhǎng)，其他菌株均生長(zhǎng)良好；在CCCP終濃度為50 μg/mL時(shí)，有6株鮑氏不動(dòng)桿菌不生長(zhǎng)，其他菌株均生長(zhǎng)良好；在 CCCP 終濃度分別為 20、10、5 μg/mL 時(shí)，所有菌株均生長(zhǎng)良好，且形態(tài)染色及菌落特征典型。故20、10、5 μg/mLCCCP均可作為實(shí)驗(yàn)用外排泵抑制劑CCCP的工作濃度。本實(shí)驗(yàn)中采用濃度10 μg/mL的CCCP。

2.3 篩選外排泵陽(yáng)性鮑氏不動(dòng)桿菌 選出臨床分離的耐環(huán)丙沙星鮑氏不動(dòng)桿菌32株，分別挑取單個(gè)菌落平板劃線于血瓊脂培養(yǎng)皿中，36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，然后分別挑取單菌落，用生理鹽水稀釋，比濁儀調(diào)節(jié)菌液至0.5麥?zhǔn)蠞舛燃s108CFU/mL，同法配制銅綠假單胞菌ATCC27853菌懸液作質(zhì)控。制備含環(huán)丙沙星的MH瓊脂平皿，CIP的質(zhì)量濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL， 將 32 株鮑氏不動(dòng)桿菌分別接種于已配制好的含不同濃度環(huán)丙沙星的MH瓊脂平皿中，細(xì)菌接種量約為105CFU。即采用瓊脂對(duì)倍稀釋法測(cè)出CIP對(duì)上述32株鮑氏不動(dòng)桿菌的最小抑菌濃度（MIC）值（藥物敏感試驗(yàn)的操作及結(jié)果的解釋參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）2011版標(biāo)準(zhǔn)［5］）。稱取 4 mg CCCP，用 2 mL 二甲基亞砜將其充分溶解，再用8 mL蒸餾水將濃度稀釋至400 μg/mL。將配制的CCCP溶液加入到含不同濃度環(huán)丙沙星的瓊脂平皿中，每個(gè)平皿中均加入0.5 mL，使每個(gè)平皿中CCCP的濃度均為 10 μg/mL，CIP質(zhì)量濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。并設(shè)一空白對(duì)照組和CCCP濃度為10 μg/mL的對(duì)照組。將32株鮑氏不動(dòng)桿菌菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液接種于上述培養(yǎng)基中，接種細(xì)菌量均為105CFU，36℃溫箱中培養(yǎng)20 h，測(cè)出環(huán)丙沙星聯(lián)合CCCP時(shí)對(duì)上述32株鮑氏不動(dòng)桿菌的MIC值。比較上述兩組MIC值，如在有CCCP的情況下MIC值下降至原來(lái)的1/4或以下，即認(rèn)為該菌株為外排泵陽(yáng)性菌株［6］（根據(jù)MIC值大小分別命名為Pa1～Pa8，見表2），空白MH瓊脂平板和CCCP濃度為10 μg/mL瓊脂平板上細(xì)菌均生長(zhǎng)良好。

2.4 外排泵陽(yáng)性鮑氏不動(dòng)桿菌株的藥敏結(jié)果 （1）測(cè)定含藥血清及空白血清MIC值：配制20 mL含藥血清及空白血清MH瓊脂平皿，含藥血清含量分別為0.5、1、2、4 mL，空白血清含量分別為 0.5、1、2、4 mL。接種上述8株鮑氏不動(dòng)桿菌菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液于含藥血清及空白血清瓊脂平皿中，細(xì)菌接種量約為105CFU，于36℃恒溫箱培育20 h。上述4個(gè)含藥血清及空白血清MH瓊脂平皿上8株鮑氏不動(dòng)桿菌菌均生長(zhǎng)良好。未測(cè)出含藥血清及空白血清的MIC值。（2）測(cè)定復(fù)方清熱顆粒的MIC值：稱取1g復(fù)方清熱顆粒，加入25 mL蒸餾水中，使之充分溶解，過(guò)濾除菌備用。配制含中藥復(fù)方清熱顆粒的MH瓊脂平皿，中藥濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL。分別接種上述 8 株菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液約105CFU于其中，并于36℃恒溫箱培育20 h，各MIC值見表3。（3）測(cè)定復(fù)方清熱顆粒+CIP組MIC值：制備含復(fù)方清熱顆粒和CIP的MH瓊脂平皿，分為4組，每組CIP的質(zhì)量濃度均包括0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。4 組的中藥濃度分別為 0.625、1.25、2.5、5 mg/mL。分別接種 8株菌懸液及質(zhì)控菌株懸液于各MH瓊脂平皿中，細(xì)菌接種量約為105CFU，并于36℃恒溫箱培育20 h，各組MIC值見表4。CIP組與CIP+中藥2.5 mg/mL組比較，差異明顯（P＜0.05）；CIP組與CIP+中藥5 mg/mL組比較，差異明顯（P＜0.01）。（4）測(cè)定空白血清+CIP 組、含藥血清+CIP組MIC值：配制含空白血清和CIP的MH瓊脂平皿，每個(gè)平皿中均加入空白血清2 mL，CIP濃度分別為1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL （命名為1組）。接種上述菌懸液于MH瓊脂平皿，細(xì)菌接種量約為105CFU，并于36℃恒溫箱培育20 h。配制含藥血清和CIP的MH瓊脂平皿，分為3組，每組CIP的質(zhì)量濃度均包括 1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。3 組瓊脂平皿中含藥血清分別為0.5、1、2 mL（命名為2、3、4組）。分別接種上述菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液于MH瓊脂平皿，菌量約為105CFU，并于36℃恒溫箱培育20 h，CIP組、空白血清+CIP組、含藥血清+CIP組MIC值比較見表5。CIP組與CIP+含藥血清2 mL組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（5）測(cè)定空白血清＋CCCP＋CIP組、含藥血清＋CCCP＋CIP組、復(fù)方清熱顆粒＋CCCP＋CIP組MIC值：制備MH瓊脂平皿，每個(gè)瓊脂平皿中均含空白血清 2 mL，CCCP的濃度均為 10 μg/mL，CIP的濃度分別為 1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL。分別接種上述菌懸液及質(zhì)控菌株菌懸液于MH瓊脂平皿，菌量約為105CFU，36℃恒溫箱培育20 h。同樣方法測(cè)定含藥血清＋CCCP＋CIP組MIC值，每個(gè)MH瓊脂平皿中均包含含藥血清2 mL，CCCP濃度、CIP濃度均同上。同樣方法測(cè)定復(fù)方清熱顆粒＋CCCP＋CIP組MIC值，每個(gè)MH瓊脂平皿中復(fù)方清熱顆粒濃度均為2.5 mg/mL，CCCP濃度、CIP濃度同上，以上分別命名為1、2、3組，各組MIC值比較見表6。CIP+CCCP組與復(fù)方清熱顆粒+CIP+CCCP組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 兩組治療前后R，HR，T，W的變化（，±s）

表1 兩組治療前后R，HR，T，W的變化（，±s）

與治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別（n＝6） 治療后模型組 治療前（n＝8） 治療后對(duì)照組 治療前R（次/min） HR（次/min） T（℃） W（kg）80.53±11.92 233.33±19.52 39.03±0.34 2.20±0.086 105.50±4.64 251.67±11.69 40.23±0.27 2.38±0.16 98.97±5.49* 235.23±17.84*39.58±0.29**2.33±0.15 78.48±15.73 233.01±23.90 39.00±0.43 2.19±0.12

表2 應(yīng)用CCCP前后CIP對(duì)外排泵陽(yáng)性鮑氏不動(dòng)桿菌MIC（μg/mL）值變化

3 討論

隨著對(duì)主動(dòng)外排系統(tǒng)的深入研究，研究發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的臨床常見病原菌存在與耐藥有關(guān)的主動(dòng)外排系統(tǒng)，細(xì)菌主動(dòng)外排作用已被認(rèn)為是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制。有研究表明［5］主動(dòng)外排泵是介導(dǎo)鮑氏不動(dòng)桿菌多重耐藥及泛耐藥的主要機(jī)制之一，與鮑氏不動(dòng)桿菌多重耐藥有關(guān)的主動(dòng)外排系統(tǒng)主要包括Ade-ABC、AdeIJK、AdeFGH，屬于 RND 家族。

為了減少細(xì)菌的多重耐藥性，筆者從細(xì)菌主動(dòng)外排泵耐藥機(jī)制入手，尋求抑制主動(dòng)外排泵的方法。CCCP是一種抑制質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的解耦聯(lián)劑，可以抑制主動(dòng)外排系統(tǒng)能量來(lái)源的質(zhì)子濃度梯度，破壞外排系統(tǒng)的主動(dòng)外排作用，使抗菌藥物在細(xì)菌體內(nèi)的累積量增加，恢復(fù)細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，但由于毒副作用過(guò)大，限制了其在臨床中的使用。這就需要研發(fā)新的毒副作用小的藥物或?qū)で笃渌緩絹?lái)改善細(xì)菌耐藥性［6］。

表3 復(fù)方清熱顆粒對(duì)鮑氏不動(dòng)桿菌MIC值的影響（mg/mL）

表4 應(yīng)用復(fù)方清熱顆粒（mg/mL）前后CIP對(duì)8株外排泵陽(yáng)性鮑氏不動(dòng)桿菌MIC值（μg/mL）

表5 應(yīng)用空白血清、含藥血清前后CIP對(duì)鮑氏不動(dòng)桿菌MIC 值（μg/mL）

表6 空白血清+CCCP+CIP、含藥血清+CCCP+CIP組、復(fù)方清熱顆粒+CCCP+CIP組MIC值（μg/mL）

本研究以中藥復(fù)方清熱顆粒含藥血清為主要研究對(duì)象，以空白血清作為對(duì)照，并且和復(fù)方清熱顆粒劑原液組進(jìn)行比較，觀察環(huán)丙沙星及環(huán)丙沙星分別聯(lián)合含藥血清、空白血清及復(fù)方清熱顆粒劑原液后對(duì)外排泵陽(yáng)性鮑氏不動(dòng)桿菌MIC值的變化。其后，在泵抑制劑CCCP抑制了外排泵后，觀察環(huán)丙沙星及環(huán)丙沙星分別聯(lián)合含藥血清、空白血清及復(fù)方清熱顆粒劑原液后對(duì)外排泵陽(yáng)性鮑氏不動(dòng)桿菌MIC值的變化。實(shí)驗(yàn)表明：（1）環(huán)丙沙星＋含藥血清組的MIC值與環(huán)丙沙星組比較，MIC值明顯下降，說(shuō)明含藥血清能明顯改善外排泵陽(yáng)性鮑氏不動(dòng)桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥情況。（2）環(huán)丙沙星＋含藥血清＋CCCP組的MIC值與環(huán)丙沙星＋CCCP組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而上面實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示含藥血清能明顯改善鮑氏不動(dòng)桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥情況，說(shuō)明CCCP阻斷外排泵后含藥血清改善鮑氏不動(dòng)桿菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的作用減弱，從而提示含藥血清可能是通過(guò)抑制鮑氏不動(dòng)桿菌的外排泵來(lái)改善鮑氏不動(dòng)桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性。（3）環(huán)丙沙星＋中藥原液組較環(huán)丙沙星組MIC值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明中藥能改善鮑氏不動(dòng)桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥情況。此外，環(huán)丙沙星＋CCCP＋中藥組MIC值較環(huán)丙沙星＋CCCP組MIC值明顯下降，表明中藥原液可能是通過(guò)多種途徑改善鮑氏不動(dòng)桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥情況。

［1］Ji Hoon，Ba Ang， Peter Axelrod.Longitudinal epidemiology o multidrug-resistant （MDR）Acinetobacter species in a tertiary care hospital［J］.American Journal of Infection Control，2011，8（11）：326-330.

［2］Ioannis K，Neonakis，Demetrios AS，et al.Confronting multidrug-resistant acinetobacter baumannii：a review［J］.International Journal of Antimicrobial Agents，2011，7：102-109.

［3］于一云，王紅，張淑文，等.復(fù)方清熱顆粒劑對(duì)MRSA PBP2a表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究 ［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2009，18（9）：1483-1486.

［4］楊鈞，張淑文，陰宏，等.復(fù)方清熱顆粒劑含藥血清對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007 13（11）：40-43.

［5］Clinical and laboratory standards institute（CLSI）/NCCLS performance standards for antimicrobial susceptibility testing：twenty-First informational supplement M100-S21（ISBN 1-56238-742-1）M07-A8-Methods for dilution antimicrobia susceptibility tests for bacteria［J］.M100-S21，2011，31（1）：1-163.

［6］馬真，蔡紹曦，佟萬(wàn)成.耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵AdeABC 的研究［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（8）：1378-1381.