慢性腎功能衰竭腎陽虛型大鼠腎組織細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體、細(xì)胞白介素-1β及腫瘤壞死因子-α的變化*

吳 凡 張紅梅 陳雪功 王億平 董昌武 周雪梅

（安徽中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)臨床學(xué)院，安徽 合肥 230038）

慢性腎功能衰竭（CRF）是指各種慢性腎病引起的腎小球濾過率下降（GFR＜90 mL/min）和腎臟其他功能損害，及由此產(chǎn)生的代謝紊亂和臨床癥狀組成的綜合征［1］。多數(shù)CRF患者以腎陽虧虛為本，濕濁內(nèi)蘊為標(biāo)。而 CRF 與白介素-1（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等微炎癥因子、及糖皮質(zhì)激素受體（GR）等同腎陽虛型CRF病證結(jié)合的研究還未涉及，本實驗對腎陽虛型CRF的證候?qū)W基礎(chǔ)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 濟(jì)生腎氣丸劑量配比參照《中醫(yī)方劑大辭典》：熟地黃15 g，山茱萸30 g，牡丹皮30 g，山藥30 g，茯苓30 g，澤瀉30 g，肉桂 15 g，附子（制）15 g，牛膝15 g，車前子30 g，由安徽中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)門診部提供。保腎康片（亨達(dá)制藥，國藥準(zhǔn)字Z20003105）；IL-1β試劑盒、TNF-α試劑盒由上海森雄實業(yè)科技有限公司提供；GR試劑盒由上海源葉生物科技有限公司提供；腺嘌呤由中科院上海生化研究所提供（分子量135.13）、尿蛋白定量試劑盒、尿素氮測定試劑盒、肌酐測定試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。尿蛋白定性測試紙由蘇州第一制藥廠生產(chǎn) （批號：20110814）。日立7020全自動生化分析儀、Multiskan MK2酶標(biāo)儀（Labsystem）、Wellwash 4 MK2 洗板機(jī)（Labsystem）、UV8100型751紫外可見分光光度計 （北京萊伯泰科儀器有限公司）、800型TGL-168離心沉淀器（江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠生產(chǎn)）、Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯公司生產(chǎn)）。

1.2 動物 SD雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由安徽省動物實驗中心提供，批號：SCXK（皖）2011-002。

1.3 分組及造模 40只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，測尿蛋白（-）。隨機(jī)分為正常組、模型組、保腎康組、濟(jì)生腎氣丸組，每組10只。參照文獻(xiàn)制作CRF腎陽虛動物模型［2］，除正常組外其他3組均以每日200 mg/kg劑量的腺嘌呤灌胃。實驗24 d，第1～12日每日灌胃1次，第12日后隔日灌胃1次。

1.4 給藥方法 濟(jì)生腎氣丸組和保腎康組均同時分別以每日40 g/kg和33.3 mg/kg的劑量進(jìn)行預(yù)防性治療，兩種藥物劑量為中等臨床劑量。造模及給藥過程中，由于灌胃等因素，模型組死亡1只，濟(jì)生腎氣丸組死亡1只，然后從各組剩余大鼠中隨機(jī)選取8只用于標(biāo)本制作和檢測。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 實驗結(jié)束前1 d代謝籠收集大鼠24 h尿液。實驗結(jié)束后，10％水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，冷凍離心（4 ℃，2000 g，10 min）收集血清，-20℃冰箱中保存待測；全自動生化儀檢測血肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白。左側(cè)腎臟制作病理切片，光鏡（×200）下觀察腎小球、腎小球囊腔、系膜及系膜基質(zhì)的病理改變；摘取右側(cè)腎臟組織100 mg，加入PBS緩沖液，按照 1∶9 比例進(jìn)行勻漿，離心（4 ℃，2000 g，10 min）收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附（Elisa）法測定腎臟組織IL-1β，INF-α及GR水平。常規(guī)進(jìn)行梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、加樣、配液、洗板、顯色等步驟，在450 nm波長測定各孔吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白定量、血清BUN及SCr水平比較 見表1。結(jié)果示，模型組大鼠24 h尿蛋白、血清BUN及SCr都顯著高于正常對照組（P＜0.05），濟(jì)生腎氣丸及保腎康都能降低24 h尿蛋白、血清BUN及SCr，與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腎組織細(xì)胞IL-1β、TNF-α及GR水平比較 見表2。模型組大鼠腎組織細(xì)胞的IL-1β、INF-α與正常組比較明顯升高（P＜0.05），GR明顯降低（P＜0.05）；而濟(jì)生腎氣丸組、保腎康組都能降低IL-1β、INF-α，升高 GR，與模型組比較差異明顯（P＜0.05）。且濟(jì)生腎氣丸在降低IL-1β、INF-α，升高GR方面更為顯著（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠腎組織病理的變化 見圖1。正常組的腎小球大小均勻，正常形態(tài)，系膜細(xì)胞及基質(zhì)無增生，毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)清晰。模型組腎小球充血，腎小體數(shù)量減少，腺嘌呤代謝結(jié)晶占據(jù)大部分腎小管和腎小球。腎小管代償性擴(kuò)張，大部分腎小管內(nèi)可見紅染的膠凍樣管型，部分腎小管被增生的纖維組織所代替，其間可見較多的淋巴細(xì)胞浸潤；少數(shù)腎小球有輕度萎縮，個別腎小球有代償性肥大。濟(jì)生腎氣丸組：腎小球輕度充血，有少量腺嘌呤代謝結(jié)晶沉積，間質(zhì)有少量炎細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張、有輕度充血。部分腎小管內(nèi)可見少量粉染分泌物，少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞有脫落。保腎康組：腎小球內(nèi)中度充血，可見較多腺嘌呤代謝結(jié)晶沉積于腎小管和腎小球，部分異形細(xì)胞形成。未被累及的腎小管管腔有擴(kuò)張，管腔內(nèi)有膠凍樣管型沉積，間質(zhì)內(nèi)有局灶性纖維組織增生。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量、血清BUN及SCr水平比較（±s）

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量、血清BUN及SCr水平比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組 別 n SCr（μmol/L）保腎康組 8 154.08±29.86*△正常組 8 63.58±9.82模型組 8 184.34±38.62*濟(jì)生腎氣丸組 8 143.62±27.60*△尿蛋白（mg/24 h）BUN（mmol/L）100.38±13.1*△ 21.08±4.53*△60.57±18.63 7.41±0.8 134.31±15.6* 33.58±7.6*82.21±7.4*△ 20.16±3.32*△

表2 各組大鼠腎組織細(xì)胞IL-1β、TNF-α及GR水平比較（pg/mL±s）

表2 各組大鼠腎組織細(xì)胞IL-1β、TNF-α及GR水平比較（pg/mL±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與保腎康組比較，☆P＜0.05。

組 別 n GR保腎康組 8 0.64±0.15*△正常組 8 1.07±0.14模型組 8 0.50±0.09*濟(jì)生腎氣丸組 8 0.787±0.09*△☆I(lǐng)L-1β TNF-α 0.74±0.03*△ 0.82±0.05*△0.35±0.03 0.512±0.03 0.90±0.042* 1.14±0.04*0.55±0.04*△☆ 0.63±0.04*△☆

圖1 各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)變化（HE染色，×200）

3 討論

CRF是一種常見的臨床綜合征。該病的發(fā)病率高，并且難以治愈，也是困擾當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的一個難題。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為CRF的病機(jī)為腎陽虧虛為本，濕濁內(nèi)蘊為標(biāo)，治療上是以溫補(bǔ)腎陽兼以化濕泄?jié)釣榉ā?/p>

IL-1β是一種具備多種生物功能的強(qiáng)有力的炎癥細(xì)胞因子，對體內(nèi)幾乎所有類型的細(xì)胞均有作用，可調(diào)節(jié)許多局部和系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，它通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子激活物蛋白和核因子xB（NF-xB）發(fā)揮生物活性，也可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖分化及活化，刺激T細(xì)胞分泌IL-2、IL-4等細(xì)胞因子，促進(jìn)IL-2受體的表達(dá)，參與腎臟的炎性改變。腎小球系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞亦可分泌IL-1β，IL-1β可通過上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞兩種骨架蛋白的蛋白合成和基因表達(dá)，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向腎間充質(zhì)細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)化［3］，從而在腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。IL-1β可通過影響腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化（EMT），從而影響腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞積聚，以及參與腎纖維化發(fā)生與發(fā)展［4］。TNF-α是機(jī)體炎癥和免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，與炎癥的關(guān)系極為密切，主要由激活的單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生，腎臟固有細(xì)胞，如系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞均能產(chǎn)生。增高的TNF-α既加重炎癥反應(yīng)及系膜細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腎單位受損和腎小球硬化；TNF-α刺激腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，使過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物增多，造成細(xì)胞內(nèi)膜損傷，調(diào)動與膠原代謝有關(guān)的細(xì)胞因子，促進(jìn)腎小球細(xì)胞釋放膠原酶，引起蛋白降解，從而加重腎功能損害。TNF-α可以促使白細(xì)胞合成，釋、放超氧化物和蛋白水解物，引起組織損傷［5］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組IL-1β和TNF-α水平明顯升高，提示炎癥細(xì)胞因子IL-1β及TNF-α在CRF中發(fā)揮重要作用，可能對腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化等產(chǎn)生一定的作用，并通過細(xì)胞因子的相互作用，共同影響CRF的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸。GR是位于細(xì)胞上或細(xì)胞內(nèi)的一類特異蛋白質(zhì)，與糖皮質(zhì)激素結(jié)合后活化，進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件，促進(jìn)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶等基因的表達(dá)。GR在下丘腦-垂體-靶腺軸（HPA軸）中占有重要地位，HPA軸與腎陽密切相關(guān)，GR表達(dá)水平的變化是腎陽虛發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)之一。本實驗發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠的24 h尿pro、BUN、Scr都明顯升高，而GR顯著降低，并且出現(xiàn)多尿、多飲、精神萎靡，逐漸出現(xiàn)食少、體質(zhì)量減輕、毛色千枯，耳輪蒼白，尾巴濕冷、活動減少、豎毛、蜷縮，外陰周圍濕毛等陽虛表現(xiàn)；而濟(jì)生腎氣丸能降低IL-1β、INF-α水平，改善陽虛表現(xiàn)，并升高GR水平。一方面說明腺嘌呤灌胃復(fù)制的CRF模型具有腎陽虛病證結(jié)合的特點；另一方面也說明濟(jì)生腎氣丸在降低BUN、Scr、改善蛋白尿上和升高GR方面有一定的療效，從方證相應(yīng)和療效反證的角度進(jìn)一步證明IL-1β、INF-α水平增高、GR水平下降等可能與CRF腎陽虧虛、濕濁內(nèi)蘊的病理本質(zhì)密切相關(guān)，而調(diào)節(jié)炎癥因子，提高糖皮質(zhì)受體水平可能成為中醫(yī)藥防治CRF的重要的方法和途徑。

［1］葉任高，李幼姬，劉冠賢.臨床腎臟病學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：530.

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