血清3型鴨甲型肝炎病毒實(shí)時熒光定量RT－PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

孫慶歌，薛 霜，肖愛芳，馬慧慧，朱 薇* ，漆世華，溫文生，舒銀輝，謝紅玲，蘇敬良

鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis)是一種嚴(yán)重危害雛鴨的急性、烈性傳染病，主要危害3周齡以內(nèi)的雛鴨，成年鴨一般可感染但不發(fā)病，所以又稱為小鴨肝炎。該病以發(fā)病急、病程短、傳播快、病死率高為特點(diǎn)，通常發(fā)病日齡越小，病死率越高［1］。鴨病毒性肝炎可由小RNA病毒科禽肝病毒屬鴨甲型肝炎病毒和星狀病毒科禽星狀病毒屬的鴨星狀病毒引起［2］。鴨星狀病毒感染地域性較為明顯，僅在英國和美國有發(fā)病報道［2］，且鴨星狀病毒致病性較鴨甲型肝炎病毒弱［3］。鴨甲型肝炎病毒，包括鴨甲型肝炎1型(DHAV－1)、2型(DHAV－2)和3型(DHAV－3)。DHAV－1即傳統(tǒng)的Ⅰ型鴨肝炎病毒，我國臺灣地區(qū)新分離株劃分為 DHAV －2［4－6］，我國和韓國新分離株被劃分為DHAV－3［7］。蘇敬良等在北京和廣西等地發(fā)病鴨場中分離到DHAV－3，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前該血清型病毒感染在河北、山東、廣東、重慶等地商品鴨群中呈流行態(tài)勢［8－9］。

目前，已有多篇文獻(xiàn)報道DHAV－1的檢測方法，包括 RT － PCR［10－12］、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(RT －LAMP)［13］及熒光 RT －PCR 等［14］。由于實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)具有敏感、特異、簡捷快速等優(yōu)勢，在動物疫病診斷領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。因此，我們根據(jù)DHAV基因差異較大區(qū)域5’UTR，同時在DHAV－3相對的序列保守區(qū)設(shè)計引物與探針，研究建立了一種可特異性檢測DHAV－3的實(shí)時熒光定量RT－PCR方法，以期為DHAV－3的臨床檢測和流行情況調(diào)查提供方便、快捷、高效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1．1 材料 DHAV－3致弱疫苗毒(B54株)、DHAV－1(ATCC株)、禽呼腸孤病毒(ARV)、5份經(jīng)鑒定的臨床分離毒株(北京J株、河北R株與H株、山東SL株、廣西GX株)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存;鴨瘟疫苗病毒(DPV CVCC AV1222株)、新城疫疫苗病毒(NDV HB1株)、禽流感病毒(AIV－H9)、傳染性支氣管炎疫苗病毒(IBV H120株)由武漢中博生物股份有限公司保存;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，北京全式金生物公司。

1．2 主要試劑和儀器 病毒核酸提取試劑盒、Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶、RT－PCR試劑盒、RNA酶抑制劑、DNA裂解酶I、T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒快速提取試劑盒、熒光定量RT－PCR試劑盒 (探針法)(TAKARA，JEP)。pEASY－T1克隆載體購自北京全式金公司(Transgen，CHN)。熒光定量PCR儀為ABIStepone Plus(ABI，USA)，紫外分光光度計UV－Visible Spectrophometer(Thermo Scientific，USA)。

1．3 方法

1．3．1 引物與探針設(shè)計 根據(jù)GenBank所發(fā)表的鴨甲型肝炎病毒相關(guān)基因組序列，利用生物學(xué)分析軟件BioEdit進(jìn)行同源性比對分析，在DHAV－3和DHAV－1及 DHAV－2核酸序列差異顯著區(qū)5’UTR(412～580 nt)，利用 Beacon Designer 7．0 設(shè)計引物和探針，于 http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi上對引物和探針進(jìn)行BLAST分析，初步檢測引物和探針的特異性。引物和探針由大連寶生物工程有限公司合成。

1．3．2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1．3．2．1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 提取鴨胚尿囊液病毒RNA，對目的基因片段進(jìn)行 RT－PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接pEASY－T1載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗性篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。將正確插入目的片段的重組質(zhì)粒送生物公司測序，保存陽性菌液及質(zhì)粒。

1．3．2．2 體外轉(zhuǎn)錄 將構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒經(jīng)Bam HⅠ酶切線性化，再進(jìn)行膠回收純化，純化產(chǎn)物在T7 RNA聚合酶于37℃作用下體外轉(zhuǎn)錄1 h，然后加入DNA裂解酶I，繼續(xù)作用30 min，消化去除模板DNA，將合成的cRNA按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南再進(jìn)行酚/氯仿/異戊醇抽取純化。紫外分光光度計測定濃度，用公式計算出每微升所含的拷貝數(shù)，作為定量標(biāo)準(zhǔn)品，加入RNA酶抑制劑置于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．3 實(shí)時熒光定量RT－PCR反應(yīng)條件的建立以制備的標(biāo)準(zhǔn)品 cRNA為模板，參考 One Step PrimeScript RT－PCR試劑盒說明書，對實(shí)時熒光定量RT－PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括引物與探針濃度的調(diào)整、退火溫度。

1．3．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 以優(yōu)化后確立的反應(yīng)條件對梯度濃度1．8×103～1．8 ×108copies/μL 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立不同模板濃度的動力學(xué)擴(kuò)增曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)作為橫坐標(biāo)，不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度的檢測CT值作為縱坐標(biāo)，由檢測儀器自帶軟件擬合出絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R2檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的可信度。

1．3．5 敏感性測定 對濃度1．8×100～1．8×103copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，同時設(shè)立陰性對照。反應(yīng)結(jié)束后，分析有特異性產(chǎn)物的最低起始模板濃度，該濃度即為所建立方法的最低檢測靈敏度。

1．3．6 特異性試驗(yàn) 提取 DHAV－3(B54株)、DHAV－1(ATCC 株)、DPV(CVCC AV1222株)、NDV(HB1株)、AIV(H9)、ARV、IBV(H120 株)的RNA，應(yīng)用優(yōu)化好的實(shí)時熒光定量RT－PCR反應(yīng)體系和條件對上述樣品進(jìn)行檢測，同時以標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照、DEPC treated water作為陰性對照。

1．3．7 重復(fù)性試驗(yàn) 對1．8 ×107、1．8 ×105、1．8 ×103copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品RNA進(jìn)行檢測，每份樣品作3個復(fù)孔，所得檢測CT值經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理后，計算批內(nèi)變異系數(shù)。

1．4 臨床樣本的檢測

1．4．1 臨床分離株的檢測驗(yàn)證 通過對5份從臨床上分離的、并經(jīng)鑒定的尿囊液病毒進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該檢測方法的有效性與特異性。

1．4．2 ELD50與實(shí)時熒光定量 RT－PCR檢測方法比較 分別收集接種病毒后58、72、84、108 h的死亡鴨胚尿囊液，每個時間點(diǎn)取等量的5份尿囊液進(jìn)行混合，先對每份混合后的尿囊液進(jìn)行鴨胚ELD50測定，再各取等量尿囊液進(jìn)行RNA的提取(按試劑盒說明書)，用所建立的方法對樣品RNA進(jìn)行定量檢測，研究ELD50與病毒拷貝數(shù)之間的對應(yīng)關(guān)系。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 引物與探針設(shè)計 篩選后的引物與探針序列:

上游引物5’－CCTTGTTGTGAAACGGATTA－3’

下游引物:5’－GGAACACCCARTAATACTRAAG－3’

TaqMan探針:5’－FAM －TAGCATCTAGTGGTTCCAGTCCATAAC－BHQ1－3’

R為兼并堿基，表示A或G兩種堿基可能性。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為120 bp。

2．2 反應(yīng)條件優(yōu)化 優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系為:2×One Step RT－PCR BufferⅢ10μL、上下游混合引物(10 μmol/L)各 0．4 μL、TaqMan混合探針(10 μmol/L)0．4 μL、Ex Taq HS(5 U/μL)0．4 μL、Prime－Script RT Enzyme MixⅡ0．4 μL、RNA 模板2μL，DEPC treated water補(bǔ)充到20μL體系。反應(yīng)程序?yàn)?42℃ 反轉(zhuǎn)錄30 min;95℃ 預(yù)變性10 s;95℃變性5 s，52℃退火30 s(收集熒光信號)，40個循環(huán)。

2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在1．8×108～1．8×103copies/μL的范圍內(nèi)可得到良好的動力學(xué)曲線(圖1a)，擴(kuò)增效率為97．5%。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0．992，提示誤差較小，可信度較高(圖1b)。

圖1 DHAV-3實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測方法的動力學(xué)擴(kuò)增曲線(1a)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(1b)

2．4 敏感性試驗(yàn) 對1．8 ×103～1．8 ×100copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，其 CT值分別為29．72、32．15、35．72、38．00，陰性對照無 CT值。根據(jù)擴(kuò)增曲線得出本方法最低可檢測至36拷貝數(shù)的目標(biāo)RNA量(圖2)。根據(jù)最低檢測樣本的CT值，并對檢測結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)定，CT值在38以下為陽性，在38～40之間為可疑，需進(jìn)行重復(fù)檢測。

2．5 特異性試驗(yàn) 結(jié)果表明，只有DHAV－3致弱疫苗株和陽性對照為陽性，其他病毒及陰性對照均為陰性，證明所建立的方法特異性良好(圖3)。

2．6 重復(fù)性試驗(yàn) 所得檢測結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理后，計算批內(nèi)變異系數(shù)分別為2．36%、1．68%和1．36%，均小于3%，說明離散程度在正常范圍內(nèi)，表明該檢測方法重復(fù)性較好，檢測結(jié)果可靠性高(圖4)。

2．7 臨床樣本的檢測

2．7．1 臨床分離株的檢測驗(yàn)證 廣西GX株和河北R株與H株(三株均為3型)的檢測結(jié)果為陽性，而北京J株和山東SL株(二者均為1型)的檢測結(jié)果均為陰性。進(jìn)一步表明該檢測方法可對不同地區(qū)分離DHAV－3實(shí)現(xiàn)有效檢測，而與DHAV－1無交叉反應(yīng)。

2．7．2 尿囊液病毒含量測定 ELD50和RT－PCR兩種檢測方法均表明，在58～84 h時病毒量逐漸升高，但在102 h時病毒含量較低，且低于58 h死亡胚尿囊液病毒含量(圖5)，說明ELD50測定與所建立的實(shí)時熒光定量RT－PCR檢測結(jié)果存在正相關(guān)。同時兩種方法都提示此疫苗毒株接毒后在84 h左右病毒含量達(dá)到最大值，過早或過晚死亡鴨胚尿囊液病毒量都會受到影響。

圖5 不同時間段死亡鴨胚的尿囊液病毒含量

3 討論

DHAV－3是近年來在我國和韓國等國家和地區(qū)出現(xiàn)的一種新型病毒，這也是免疫了傳統(tǒng)的DHAV－1型疫苗和卵黃抗體后，鴨肝炎病毒病仍時有發(fā)生，以及發(fā)病后很難控制的主要原因［8，11］。雖然中和試驗(yàn)為鴨肝炎確診的可靠方法，但該方法操作繁瑣，耗時費(fèi)力，不利于疾病的早期快速診斷。另外還有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、免疫膠體金電鏡技術(shù)、間接 ELISA和 DOT－ELISA以及RT－PCR等，但基本是對DHAV－1型病毒進(jìn)行檢測［15］。由于DHAV－3在分子遺傳學(xué)和抗原性上與DHAV－1差異性較大，故以上報道的方法能否適合DHAV－3的檢測還是未知。而目前報道的關(guān)于DHAV－3檢測方法相對較少，對DHAV－3引起的鴨肝炎的預(yù)防和控制帶來很大的難度。

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分子檢測技術(shù)，通過在反應(yīng)體系中加入熒光基因，檢測反應(yīng)過程中熒光信號值的變化情況，實(shí)時判斷模板中有無靶基因以及靶基因的擴(kuò)增情況。近幾年來實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在動物疫病的診斷中也得到了越來越廣泛的應(yīng)用［16－18］。TaqMan探針法實(shí)時熒光PCR是一種應(yīng)用比較廣泛的熒光PCR技術(shù)，檢測特異性相對較高，但該方法對引物和探針的要求也相對較高，尤其是探針的設(shè)計必須要保守、特異。DHAV雖然在3D區(qū)域十分保守，但是該區(qū)域內(nèi)設(shè)計出特異性檢測DHAV－3的引物與探針，極為困難。參考文獻(xiàn)［19］，對DHAV－3 5’UTR區(qū)域進(jìn)行序列比對，選擇對于DHAV－3相對保守、特異區(qū)域進(jìn)行引物與探針的設(shè)計。針對于有些DHAV－3毒株，可能有些堿基發(fā)生變異，因此在引物設(shè)計上采用兼并引物，以最大限度防止假陰性的產(chǎn)生。

我們所建立的實(shí)時熒光定量RT－PCR檢測方法，可在90 min內(nèi)完成樣品中RNA的檢測，相比傳統(tǒng)的RT－PCR、套式PCR等分子診斷方法，更加快捷、方便，且靈敏度更高。本研究為DHAV－3的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了新的方法。對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)品cRNA，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可對檢測樣品中的病毒拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量。通過該方法可以對雞(鴨)胚培養(yǎng)的DHAV－3進(jìn)行定量檢測，為繁瑣、耗時的ELD50測定提供了一種參考檢測方法。不足之處是該方法所檢測的病毒拷貝數(shù)為樣品中總核酸拷貝數(shù)，而ELD50測定的是樣品中活病毒量。如果病毒培養(yǎng)條件一致，收獲及時，病毒保存條件適當(dāng)，使用熒光定量RT－PCR檢測出的病毒拷貝數(shù)與ELD50測定數(shù)值理論上呈正相關(guān)。因此通過檢測所收獲尿囊液病毒拷貝數(shù)，就可對ELD50進(jìn)行初步估計，為疫苗的生產(chǎn)提供了一種質(zhì)量快速檢測手段。

［1］ 施少華，陳 珍，黃 瑜．新型鴨病毒性肝炎最新研究進(jìn)展［J］．福建畜牧獸醫(yī)，2008，30(4):33 －34．

［2］ Fauquet C M，Mayo A，Maniloff J，et al．Virus taxonomy［M］．Eighth Report of International Committee on Taxonomy of Viruses，Calif:Elsevier Academic Press，2005:757 －778．

［3］ 張艷芳，羅 薇，劉 群，等．鴨肝炎病毒研究進(jìn)展［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2011，7(38):171 －175．

［4］ 袁率珍，范書才，李 虹，等．鴨肝炎病毒分子流行病學(xué)分析［J］．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，11(32):849 －853．

［5］ Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，et al．Recent Korean isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of a new geno－and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 strains［J］．Arch Virol，2007，152:2059 －2072．

［6］ Tseng C H，Tsai H J．Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus［J］．Virus Res，2007，126(1 － 2):19－31．

［7］ Fu Y，Pan M，Zhang D，et al．Molecular detection and typing of duck hepatitis A virus directly from clinical specimens［J］．Vet Microbiol，2008，131(3/4):247 － 257．

［8］ 劉 建，蘇敬良，張克新，等．新型鴨肝炎病毒流行病學(xué)調(diào)查及免疫防治試驗(yàn)［J］．中國獸醫(yī)雜志，2006，42(2):3 －6．

［9］ 蘇敬良，黃 瑜，賀榮連，等．新型鴨肝炎病毒的分離及初步鑒定［J］．中國獸醫(yī)科技，2002，1:15 －16．

［10］羅玉均，張桂紅，陳建紅，等．Ⅰ型鴨肝炎病毒R株全基因組分析與檢測技術(shù)的研究［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41(9):2835－2842．

［11］ Kim M C，Kwon Y K，Joh SJ，et al．Differential diagnosis between type－specific duck hepatitis virus type 1(DHV－1)and recent Korean DHV－1－like isolates using a multiplex polymerase chain reaction［J］．Avian Pathology，2008，37(2):171 －177．

［12］ Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，et al．Development of one － step reverse transcriptase－polymerase chain reaction to detect duck hepatitis virus type 1［J］．Avian Disease，2007，51(2):540－545．

［13］ Yang L，Li J，Bi Y，etal．Developmentand application of a reverse transcription loop－mediated isothermal amplification method for rapid detection of Duck hepatitis A virus type1［J］．VirusGenes，2012，45(3):585 －589．

［14］ Yang M，Cheng A，Wang M．et al．Developmentand application of a one－step real－time Taqman RT－PCR assay for detection of Duck hepatitis virus type 1［J］．Journal of Virological Methods，2008，153:55 －60．

［15］ Liu M，Zhang T，Meng F，et al．Development and evaluation of a VP1－ELISA for detection of antibodies to duck hepatitis type 1 virus［J］．Journal of Virological Methods，2010，169(1):66 －69．

［16］ Wilhelm S，Zimmermann P，Selbitz H J，et al．Real－ time PCR protocol for the detection of porcine parvovirus in field samples［J］．Journal of VirologicalMethods，2006，134(1/2):257 －260．

［17］ Paul F H，Timothy JM．Multiplex real－time RT－PCR detection of three virusesassociated with the bovine respiratory disease complex［J］．Journal of Virological Methods，2011，171:360 －363．

［18］ Meir R，Maharat O，F(xiàn)arnushi Y，et al．Development of a real－ time TaqMan RT－PCR assay for the detection of infectious bronchitis virus in chickens，and comparison of RT － PCR and virus isolation［J］．Journal of Virological Methods，2010，163(2):190 －194．

［19］楊 利，曹三杰，文心田，等．實(shí)時熒光定量PCR檢測胸膜肺炎放線桿菌方法的建立及應(yīng)用［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2010，18(5):1024－1030．