siat7e基因和st3gal I基因雙表達載體的構建及其初步應用

陳小云，張 敏，張啟龍，王 磊，王 棟，蔣桃珍

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

大多數連續細胞系在大規模病毒生產過程中的一個重要缺陷是由于這些細胞屬于貼壁依賴性細胞，因而需要表面貼附以進行增殖。在工業化生物反應器生產中，采用微載體可以提供細胞生長表面。盡管這一方案能獲得較高的病毒產率，但是，與全懸浮細胞增殖方案相比，這一方案還是顯得過于繁瑣。因此，構建和應用能在全懸浮條件下增殖的MDCK細胞系，將極大方便禽流感病毒的放大培養工藝。

由于 MDCK細胞自身的貼壁特性較強，與BHK－21細胞相比，采用常規的懸浮細胞馴化技術，很難直接將MDCK細胞馴化為適應全懸浮培養條件的細胞。并且，由于現行《中國藥典》和《中國獸藥典》對用于疫苗生產的傳代細胞的代次范圍都有較嚴格的規定，以防傳代細胞在超過一次的代次范圍后，產生致腫瘤性等安全性問題。這也限制了采用長期懸浮培養的方法，將貼壁依賴性MDCK細胞馴化為適應全懸浮培養細胞的策略。因此，有必要嘗試采取其他更為快捷而有效的馴化方法。已有的研究表明，將控制細胞帖壁生長特性的人類siat7e基因，轉染MDCK細胞，能夠使該細胞失去貼壁依賴特性，從而適應懸浮培養環境［1］。

此外，流感病毒通過其表面的血凝素(HA)與細胞表面唾液酸寡糖受體結合侵染宿主細胞。禽流感病毒傾向識別 α－2，3連接型受體(NeuAc α －2，3－Gal)，而人流感病毒傾向識別 α －2，6連接型受體(NeuAcα－2，6－Gal)。目前 H5N1和H9N2亞型流行株仍保持典型的 NeuAcα－2，3－Gal受體結合傾向性，因此，提高 MDCK工程細胞系表面受體豐度，有可能改進禽流感病毒分離株的生長滴度及蝕斑形成能力。

為此，本研究克隆了編碼人的唾液酸轉移酶ST6GalNacⅤ的siat7e基因，以及雞 β－半乳糖苷α－2，3－唾液酸轉移酶Ⅰ(st3galⅠ)基因，并將它們構建在同一個真核表達載體，進行雙基因表達，以期構建能夠適應懸浮培養，并且對禽流感病毒更加易感的MDCK細胞系，為應用MDCK細胞規?；a禽流感疫苗奠定基礎，并為其他貼壁細胞的懸浮馴化提供新思路。

1 材料與方法

1．1 菌株與載體 受體菌DH5α購自北京紐樸生物技術開發中心;pMD18－T載體購自寶生物工程有限公司。真核表達載體pReceiver，本室保存。

1．2 試劑 基因組提取試劑盒 QIAamp? DNA Mini Kit，QIAGEN公司產品;Taq DNA聚合酶、DL－2000 DNA分子量標準、限制性內切酶Bam H I、PstⅠ、Sac I和 Xho I、IPTG、X － Gal、dNTP，寶生物有限公司;氨芐青霉素、瓊脂糖凝膠，Sigma公司;DNA片段玻璃奶快速純化回收試劑盒，博大泰克生物基因技術有限公司;質粒小量快速提取試劑盒，北京天根生物技術公司。

1．3 人和雞基因組DNA的提取 參照基因組提取試劑盒QIAamp? DNA Mini Kit的說明書中介紹的血液中基因組提取方法進行，并稍作修進。具體步驟如下:取1．5 mL 血液，10000 ×g離心2 min，棄上清;用180μL酶裂解緩沖液重懸沉淀，37℃作用45 min;加25μL蛋白酶K和200μL緩沖液AL，渦旋混勻，70℃作用30 min;加200μL無水乙醇，渦旋混勻后，加入DNeasy微型離心柱上，8000×g離心1 min;將DNeasy微型離心柱放入一個新的2mL收集管中，加入500μL緩沖液AW2，14000×g離心5 min;將DNeasy微型離心柱放入一個新的1．5 mL eppendorf管中，加入200 μL 緩沖液 AE，室溫放置1 min，8000×g離心1 min，濾出液即為純化后基因組DNA溶液。

1．4 引物設計 參考GenBank中已登錄的siat7e基因st3gal I基因序列，利用Oligo6．0軟件，自行設計并合成了2對引物，其中引物對 V1581U/V1581L，用于擴增siat7e基因。這對引物的擴增產物包含了完整的siat7e基因序列，并在ORF兩端引入了便于進一步克隆的兩個酶切位點BamH I和PstⅠ(下劃線表示)。預期的擴增產物大小為1027 bp。引物對C0384U/C0384L，用于擴增st3gal I基因。這對引物的擴增產物包含了完整的st3gal I基因序列，并在 ORF兩端引入了便于進一步克隆的兩個酶切位點 Sac I和Xho I(下劃線表示)。預期的擴增產物大小為1047 bp。具體引物序列如下:

1．5 PCR擴增 以純化后的人和雞基因組DNA為模板，進行PCR擴增。采用50μL反應體系:10 ×Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，10 mmol/L dNTP 2μL，25 mmol/L的上下游引物各1μL，模板DNA 5 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0．5 μL，補加滅菌超純水至總體積50μL。反應條件:95℃預變性5 min，加入 Taq DNA聚合酶;94℃ 40 S，52℃40 S，72℃ 80 S，共進行31個循環;最后72℃延伸10 min。取8μL PCR產物，用1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增結果。

1．6 PCR產物的純化、酶切、連接與轉化 用1．5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，切下目的條帶，用DNA片段玻璃奶快速純化回收試劑盒回收。連接時，首先將V1581U/V1581L引物對的擴增產物，以及C0384U/C0384L引物對的擴增產物，分別與pMD18－T載體連接，在0．5 mL eppendorf管中加入1μL pMD18－T載體和4μL純化后的PCR產物，再加入5μL Ligation SolutionⅠ，16℃反應30 min;取出5μL，加入與DH5α感受態細胞配套的溶液A(10μL)和溶液B(35μL);加入50μL感受態細胞，冰上放置20 min，再室溫放置10 min;再加入 200μL LB培養基，37℃ 150 rpm振蕩40 min;取200μL菌液涂布于LB/Amp+/XGal/IPTG平板上，37℃培養過夜(12－16 h)，觀察菌落生長情況，根據藍白斑篩選重組轉化菌。得到的重組質粒分別命名為pMD18－V1581和pMD18－C0384。

1．7 重組PCR產物質粒的酶切及真核表達載體的構建及鑒定 將pMD18－V1581質粒及重組表達載體pReceiver，分別用內切酶Bam H I和PstⅠ進行雙酶切，連接，得到重組載體pRE－SIAT。再將pMD18－C0384質粒及構建的重組載體 pRESIAT用內切酶Sac I和Xho I進行雙酶切，連接，獲得pRE－SIAT－ST3重組真核表達載體。轉化DH5α細胞，挑取白色菌落，經培養后采用質粒小量快速提取試劑盒提取質粒。從載體pRE－SIAT－ST3中選擇位于插入片段兩側的兩個酶切位點Bam H I/PstⅠ，以及內切酶Sac I/Xho I進行雙酶切鑒定。將酶切鑒定的重組質粒用無菌超純水稀釋100倍，取1μL為模板，采用前述反應體系和反應條件進行PCR擴增。同時，采用PCR上游引物作為測序引物，對酶切和PCR鑒定呈陽性的重組質粒進行序列測定。由北京三博遠志公司完成。

1．8 重組載體pRE－SIAT－ST3電轉化MDCK細胞 采用德國QIAGEN公司質粒純化試劑盒，提取pRE－SIAT－ST3質粒，并將質粒濃度調整為1μg/mL。將MDCK細胞擴大培養后，胰酶消化，離心后，作細胞計數，并用BioRAD公司的電擊緩沖液，將細胞濃度調整為1．1×106活細胞/mL。取10μL質粒，加入90μL細胞懸液，采用BioRAD電轉化儀，在0．2 cm電擊杯中進行電擊。電擊條件為:150 V，5 ms。電擊后，立即將細胞輕柔加入到含有5mL完全生長培養液的6孔細胞板內，37℃，5%CO2培養箱中培養。同時，設立未轉化的正常MDCK細胞對照。

1．9 轉化細胞的熒光觀察 將電轉化的MDCK細胞，在6孔板中培養24小時后，采用Olympus IX71倒置熒光顯微鏡，進行熒光顯微鏡觀察。由于表達載體pRE－SIAT－ST3中帶有eGFP序列，因此，轉化后的MDCK細胞，應可觀察到綠色熒光。

2 結果與分析

2．1 siat7e基因和st3gal I基因的擴增 在進行了31個循環的擴增后，經1．5%瓊脂糖凝膠電泳，并與DL－2000標準分子量比較，結果表明，得到了大小分別為1027 bp和1047 bp的siat7e基因和st3gal I基因片段(圖1)。

圖1 siat7e基因和st3gal I基因的PCR擴增

重組表達載體的鑒定將構建的重組真核表達載體pRE－SIAT－ST3，分別采用兩組內切酶，即內切酶Bam H I/PstⅠ以及內切酶Sac I/Xho I，分別進行雙酶切鑒定，均能得到預期大小的片段。采用引物對V1581U/V1581L和C0384U/C0384L進行PCR鑒定，得到的PCR產物大小，也與預期一致(圖2)。同時，采用PCR的上游引物，對重組載體進行序列測定，結果表明，序列是正確的。

圖2 siat7e基因和st3gal I基因的PCR擴增

2．3 電轉化細胞的熒光顯微鏡觀察 采用Olympus IX71倒置熒光顯微鏡，通過觀察載體自帶的eGFP熒光蛋白的表達情況，驗證外源基因的表達情況。由于eGFP位于外源基因的C端，因此，從理論上講，只有充分表達外源基因后，eGFP才會得到表達。觀察結果表明，與對照細胞相比，電轉化MDCK細胞可見明顯的綠色熒光，證明eGFP基因得到了有效的表達(結果見圖3)。

圖3 轉染雙基因真核表達載體的MDCK細胞的熒光觀察

3 討論

目前，工業化生產流感疫苗，已有若干細胞系可供選擇。但是，一方面新近發展起來細胞系，如人PER．C6、鴨 EB66或鴨 AGE1．CR 細胞等，這些細胞系是為了疫苗生產而特別研制的，通常在無血清條件下懸浮培養。然而，除了PER．C6細胞外，對于大規模生產中的細胞生長和病毒復制僅僅進行了極少的研究，背景研究資料的匱乏反過來限制了這些新細胞系的進一步應用。更為重要的是，這些細胞系都受到了嚴格的專利保護;另一方面，可以通過商業途徑獲得的貼壁細胞系，如綠猴腎細胞(Vero)或MDCK細胞，是當前流感疫苗生產最有希望的哺乳動物細胞系，并且多年來已對這兩個細胞系進行了較為系統和詳盡的研究。其中MDCK細胞是培養和分離流感病毒的最佳哺乳動物細胞系，此細胞系具有感染后迅速產生流感病毒、在短時間內取得高滴度和產生的流感病毒血凝素(HA)含量高等特點，并且可用于增殖大多數流感病毒。更為重要的是，采用MDCK細胞培養生產的疫苗，其誘導的免疫反應，與雞胚源疫苗一樣良好［2］。美國富道公司實驗室已經將MDCK細胞系應用到馬流感疫苗的生產中，這種流感疫苗生產工藝的轉變使生產成本下降到雞胚培養工藝的40%，而抗原的效力卻提高了3倍，同時消除了外源因子污染的危險。有研究者比較了在不同類型微載體上培養的MDCK細胞，與雞胚之間在增殖A型流感病毒能力上的差異，發現在攪拌瓶培養的以Cytodex I為微載體的細胞，其毒價上可達5．0×104HAU/mL，而雞胚則為2．0×105HAU/mL。根據這一數據，他們估算在固相微載體上培養的1000 L MDCK細胞，約等于30000枚雞胚，或者說是1 L等于30枚雞胚［2］。

研究者通過采用DNA微矩陣的方法，比較了貼壁依賴性和貼壁非依賴性Hela細胞的轉錄譜，發現siat7e(ST6GalNacⅤ)是控制細胞貼壁程度的重要基因［3］。通過顯微評估和監測細胞在剪切流體腔中的脫壁情況，發現更高水平的siat7e基因轉錄對應于更低程度的細胞貼壁，而用siRNA抑制siat7e基因轉錄，能顯著增強細胞的貼壁功能。siat7e基因編碼人的唾液酸轉移酶ST6GalNacⅤ，該酶屬于唾液酸轉移酶ST6GalNac家族的成員，是一種Ⅱ型高爾基膜蛋白，能將唾液酸從供體CMPNeu5Ac轉移至神經節苷脂GalNac殘基GM1b上，形成GD1α［4］。國外已有研究者將siat7e基因轉染MDCK細胞，成功獲得了適應懸浮培養環境的MDCK細胞系［1］。

本研究構建的siat7e基因和st3galⅠ基因雙基因真核表達載體，在轉化MDCK細胞后，若能使MDCK細胞適應懸浮培養，并且對禽流感病毒更加易感，為極大地方便應用MDCK細胞規?；a禽流感疫苗。目前，我們已通過本研究獲得了該載體，并在將該真核表達載體電轉化MDCK細胞后，成功觀察到了外源基因eGFP的表達，初步證實我們構建的真核表達載體pRE－SIAT－ST3已成功轉化至MDCK細胞，并得到了有效表達。下一步，我們將進一步研究載體中的兩個外源基因siat7e基因和st3gal I基因的表達情況，以及轉化后MDCK細胞的表型特征，特別是其適應懸浮培養的特性，以及對禽流感病毒的敏感性。