豬肺炎支原體體外抗菌藥物敏感性試驗研究

張純萍，沈青春，胡海燕，王 芳，徐士新，寧宜寶，高和義

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

豬肺炎支原體是引起豬支原體肺炎(又稱豬喘氣病)的病原，在規模化養殖場普遍存在，給世界各國的養豬業帶來巨大危害［1］。雖然使用疫苗可以有效地減少感染，但是在飼料和飲水中使用抗生素仍舊為養殖場常用的豬支原體肺炎的防治策略。目前對豬肺炎支原體耐藥性研究的資料很少，主要是由于肺炎支原體生長條件苛刻，生長緩慢，因此其臨床分離甚至培養均異常困難。目前世界各國，包括美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)和歐盟抗菌藥物敏感性檢測委員會(EUCAST)均沒有豬肺炎支原體對抗菌藥物敏感性檢測的相應標準。本研究參考相應文獻［2］，采用宏量肉湯稀釋法，對本實驗室保存和分離的4株豬肺炎支原體進行了10種抗菌藥物的敏感性檢測，以了解其對臨床常用抗菌藥物的敏感性，為豬支原體肺炎的防控提供數據和技術支持。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 豬肺炎支原體 共4株，分別為北京(BJ)株、232株、濟南(JN)株和RM48株，均由本實驗室保存。其中BJ株為2009年本實驗室分離;232株為美國引進標準株;JN株分離自20世紀60年代;RM48株為2003年馴化株。

1．1．2 測試抗菌藥物 泰樂菌素、替米考星、林可霉素、頭孢噻呋、磺胺甲惡唑、多西環素、氟苯尼考和泰妙菌素均由中國獸醫藥品監察所提供;四環素和環丙沙星購自中國食品藥品檢定研究院。

1．1．3 支原體培養基 根據《中華人民共和國獸藥典》中支原體培養基的配制方法［3］配制。

1．2 方法 采用宏量肉湯稀釋法測定豬肺炎支原體對抗生素的敏感性。其中替米考星和泰樂菌素的最終稀釋濃度范圍為0．004～0．5μg/mL，其余8種藥物的最終稀釋濃度范圍均為0．03～4μg/mL。

1．2．1 豬肺炎支原體懸液的配制 根據Ter Laak等的方法［2］略加改動。將凍存的4株豬肺炎支原體用新鮮配制的培養基進行復蘇和傳代，測定滴度為每毫升109顏色改變單位(CCU)，然后用培養基無菌稀釋至104CCU/mL，作為接種用懸液備用。

1．2．2 不同濃度抗菌藥物溶液的制備 根據抗菌藥物的含量等進行計算并稱量，然后用相應溶劑［4］分別配制成濃度為 5120μg/mL的儲備液，置－40℃冰箱保存備用。每種藥物均為8個稀釋濃度。首先將抗菌藥物儲備液用肺炎支原體培養液稀釋至最高稀釋濃度的兩倍:大環內酯類藥物為1μg/mL，其余8種藥物均為8μg/mL。將2 mL最高稀釋濃度的藥物加至第1支無菌小管中，其余7支小管中加入1 mL培養液，從第1管吸取1 mL至第2管中倍比稀釋直至第8管，并從第8管中吸出1 mL廢棄。

1．2．3 耐藥性測定 將104CCU/mL的豬肺炎支原體懸液1 mL加至每一個無菌小管中，此時管中的抗生素濃度相應地稀釋為原來的一半，而每個管中支原體的濃度也變為5×103CCU/mL。同時設置陰性和陽性對照管。置于溫箱(36±1)℃培養。于試驗第5天開始觀察結果，培養基顏色由紅色變為黃色，說明有肺炎支原體生長。在陽性對照變為黃色而陰性對照顏色無明顯變化，而且連續兩天的觀察結果相同時，則以顏色沒有明顯變化的最低藥物濃度為肺炎支原體對該藥物的MIC值。

2 結果

試驗第5天至第7天觀察結果，發現部分藥物的MIC值發生了改變:4株菌對泰樂菌素的MIC值均由0．06μg/mL變為0．12 μg/mL;232株對多西環素和四環素的 MIC值分別由第5天的0．06、0．03μg/mL變為第7天的 0．12和 0．06 μg/mL;RM48和BJ株對四環素和多西環素的MIC值則分別由第5天時的0．06、0．12μg/mL變為第7天時的0．12和0．25μg/mL。而在實驗的第7～10天進行觀察時，4株豬肺炎支原體對10種藥物的MIC值均未發生變化，因此選用第7天的觀察結果判定本研究中豬肺炎支原體對抗菌藥物的MIC值，具體見表1。

表1 豬肺炎支原體對抗菌藥物的M IC值 μg/m L

由表1可知，4株豬肺炎支原體除了對四環素類藥物的MIC值有差異外，對其余抗菌藥物的MIC值基本相同。豬肺炎支原體對泰妙菌素和環丙沙星最為敏感，其MIC值均小于所測試的最低藥物濃度，而對頭孢噻呋和磺胺甲惡唑的MIC值則均高于所測試的最高藥物濃度，對氟苯尼考的MIC值為1～2μg/mL。根據豬肺炎支原體對藥物的敏感性判定標準［5］，BJ株已經對氟苯尼考產生了耐藥性。此外，豬肺炎支原體對同類藥物的MIC值之間也存在差異:4株支原體對泰樂菌素的 MIC值均為0．12 μg/mL，而對替米考星的MIC 值則均 ＞0．5 μg/mL，是對泰樂菌素MIC值的4倍以上;不同支原體分離株對四環素類藥物的耐藥性也存在差異:JN株對多西環素和四環素的MIC值均不高于0．03μg/mL，而BJ株則均在JN株的4倍以上。

3 討論

支原體是一種最小的可獨立生存的微生物，直徑約300 nm。與細菌不同，支原體沒有堅硬的細胞壁，僅有一個三層的膜結構，因此各種作用于細胞壁的藥物對其無效，如β－內酰胺類藥物。本實驗中頭孢類抗生素也是作用于細胞壁的藥物，因此其對肺炎支原體的MIC值大于所測試的最高藥物濃度。

一般認為，肺炎支原體對影響蛋白質合成的藥物都比較敏感［6］。本研究的結果基本證實了這一點。其中泰妙菌素和氟喹諾酮類抗生素對豬肺炎支原體的MIC均低于0．03μg/mL，是治療豬肺炎支原體感染的有效抗菌藥物，其余依次為四環素類藥物(包括四環素和多西環素)、林可霉素和泰樂菌素，這與其他研究［2，7］的結果一致。大環內酯類抗生素是臨床治療兒童和成人肺炎支原體感染的一線抗菌藥物，目前人醫臨床分離株對該藥物的耐藥性報道日漸增加［8－9］。本實驗僅測試了豬肺炎支原體對兩種獸醫專用大環內酯類抗生素(替米考星和泰樂菌素)的MIC值，結果表明其對替米考星的MIC值遠高于對泰樂菌素的MIC值，具體原因有待進一步研究。本研究中BJ株對獸用抗菌藥物氟苯尼考已經產生了耐藥性，推測這可能與其在獸醫臨床上的廣泛使用有關。

本研究結果表明，盡管豬肺炎支原體對所測試抗菌藥物的MIC值不同，但是對多數藥物均較敏感，有利于獸醫臨床對豬支原體肺炎的防控。在實際臨床工作中，我們應加強對病原菌的耐藥性監測，根據藥敏結果合理選用抗菌藥物，以更好地防控疾病的發生和蔓延。

［1］ 沈青春，寧宜寶，覃青松．豬肺炎支原體的研究進展［J］．中國獸藥雜志，2003，37(6):26 －30．

［2］ Ter Laak E A，Pijpers A，Noordergraaf JH，et al．Comparison of methods for in vitro testing of susceptibility of porcine Mycoplasma species to antimicrobial agents［J］．Antimicrob Agents Chemoth，1991，35(2):228 －233．

［3］ 中華人民共和國獸藥典二OOO年版一部［S］．

［4］ Clinical and Laboratory Standards Institute．Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals，approved standard，third edition，M31 － A3［S］．2008．

［5］ Omer A IKibeida．A comparison ofmethods used tomeasure the in vitro antimicrobial susceptibilities of Mycoplasma species of animal origin［M］．2010．

［6］ David Taylor － Robinson and Christiane Bébéar．Antibiotic susceptibilities of mycoplasmas and treatment of mycoplasmal infections［J］．JAntimicrob Chemoth．1997，40:622 － 630．

［7］ Hannan PC，O＇Hanlon P J，and Rogers N H．In vitro evaluation of various quinolone antibacterial agents against veterinary mycoplasmas and porcine respiratory bacterial pathogens［J］．Res Vet Sci，1989，46:202 －211．

［8］ Zhao F，Lv M，Tao X X，et al．Antibiotic sensitivity of 40 Mycoplasma pneumoniae isolates and molecular analysis ofmacrolideresistant isolates from Beijing，China［J］．Antimicrob Agents Chemoth，2012，56(2):1108 －1109．

［9］ Liu Y，Ye X Y，Zhang H，et al．Characterization of macrolide resistance in Mycoplasma pneumonia isolated from children in Shanghai，China［J］．Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2010，67:355 －358．