兔體中和試驗用豬瘟病毒陰、陽性血清國家參考品的研制

戴志紅，蔣 卉，關孚時，孫海燕，李 翠，張秀英，張瑞婷，張立春，王在時

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國家和地區均有發生［1－2］，給畜牧業生產帶來了嚴重的經濟損失。世界動物衛生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報性疫病［3］，我國將其劃為一類動物傳染病［4］，并納入重大動物疫病防控計劃。兔體中和試驗是我國檢測豬瘟病毒抗體檢測的重要法定方法之一，豬瘟兔化弱毒種毒特異性檢驗和豬瘟活疫苗鑒別檢驗的法定方法也是兔體中和試驗［5－6］，但該試驗的敏感度、準確性易受人員、試劑、實驗動物等諸多因素的影響。而兔體中和試驗用豬瘟病毒陰、陽性血清國家參考品則是控制和校準該試驗的實物“標尺”。因此，需及時研制該國家參考品。

根據 WHO［7］和國家一級標準物質技術規范［8］規定，標準物質的定值方式有4種:絕對測量法、用兩種不同原理的可靠方法測量法、溯源法、多個實驗室協作標定定值法。本研究按照相關程序和要求制備兔體中和試驗用豬瘟病毒陰、陽性血清國家參考品，并進行了協作標定定值。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 種毒和細胞 CSFV石門株(F114)、豬瘟兔化弱毒種毒(F480)、PK－15細胞(F145)，由中國獸醫藥品監察所鑒定、保存。

1．1．2 主要試劑和耗材 豬瘟活疫苗(兔源)，由乾元浩生物股份有限公司提供;豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒，Idexx公司;豬瘟熒光抗體，由中國獸醫藥品監察所制備;Taq DNA聚合酶、dNTPs、RNasin、RNase FreeWater、RNA 提取試劑 TRIzol Reagent、反轉錄酶SSⅢ，Invitrogen公司;MEM培養基、胎牛血清、胰酶，Gibico BRL公司;48孔細胞培養板，CoStar公司。

1．1．3 實驗動物 普通健康非免疫豬，20 kg左右，購于內蒙某豬場，經農業部獸醫診斷中心檢測為口蹄疫、偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病病原抗體陰性(病原用PCR或RT－PCR方法檢測，抗體用ELISA方法檢測)，飼養于隔離動物室內待用;18～22 g小白鼠、1．5～3 kg日本大耳白兔、350～400 g豚鼠，均為清潔級，北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1．2 方法

1．2．1 免疫原制備 按文獻方法［5］在強毒隔離動物室制備，－20℃以下凍存備用。

1．2．2 候選物制備

1．2．2．1 陰、陽性血清制備 將非免疫豬頸動脈采血致死，按常規方法分離制備陰性血清;將非免疫豬免疫豬瘟兔化弱毒疫苗2頭份，3周后采血樣分離血清，經豬瘟病毒抗體ELISA檢測試劑盒檢測抗體效價≥1∶2，將其頸動脈采血致死，按常規方法分離制備弱陽性血清;按文獻方法［5］在強毒隔離動物室強化免疫動物后，將其頸動脈采血致死，按常規方法分離制備強陽性血清。所有血清－20℃以下凍存備用。

1．2．2．2 血清過濾、分裝、凍干、熔封 將3亞批血清分別先經0．4μm無菌濾膜加壓過濾，再經0．22μm無菌濾膜加壓過濾;隨后用瓶頸分液器(分裝精度為±0．01 mL)無菌分裝至1 mL滅菌長安瓿，分裝過程中用攪拌子低速攪拌血清;按常規方法凍干、抽真空、熔封。將陰性、弱陽性、強陽性血清批號分別確定為200905－1、200905－2、200905－3

1．3 候選物檢驗

1．3．1 物理性狀 每亞批隨機抽取5支樣品，觀察顏色和形狀，再打開安瓿加去離子水(可以低速渦旋或用移液器輕輕吹打)，記錄溶解所需時間和溶解后性狀。

1．3．2 無菌檢驗、安全檢驗、支原體檢驗、真空度測定 隨機抽取規定數量的樣品，按文獻［6］中的相應方法進行。

1．3．3 剩余水分測定 采用真空干燥法［6］。

1．3．4 均勻性檢驗 每亞批隨機抽取16支血清復溶，其中1支取樣10 次，其余各支取樣1次［9－10］，用豬瘟病毒抗體ELISA檢測試劑盒一次檢測所有取樣的 OD450值，再進行 t檢驗和 F 檢驗［11－12］。

1．3．5 保存有效期試驗 按文獻［13－15］方法進行，隨機抽取40支血清樣品，分別在25、37、45、56 ℃下保溫，分別于0～24周隨機抽取1支樣品，按照1∶400、1∶450～1∶800系列稀釋，用豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒檢測其效價(最大陽性稀釋倍數)。將不同溫度下的加速穩定性數據按公式(1):ln c=ln c0－kt擬合線性回歸方程，求出不同溫度下的k值;再將k值按公式(2):ln k=－Ea/RT+ln A擬合線性回歸方程，求出－20℃下的k值;最后根據－20℃下的k值及公式(1)，計算出樣品效價由初始效價降低到目標效價所需的時間，即貯存有效期。

1．3．6 特異性檢測 每亞批隨機抽取5支樣品，同一亞批復溶混合后委托農業部獸醫診斷中心進行口蹄疫、偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病抗體檢測(均用ELISA方法進行)。另外，將3亞批血清加1 mL生理鹽水復溶后，分別加入等量已稀釋至100兔體感染量(Rabbit infection dose，RID)/mL的豬瘟兔化弱毒種毒，置15℃中和2 h，期間振搖3次。同時設生理鹽水和空白對照。中和結束后，分別接種大耳白兔2只，每只耳緣靜脈接種1 mL。按文獻方法［6］測溫和判定熱反應。

1．3．7 殘余 CSFV 檢測 將200905－2和200905－3亞批血清各隨機抽取5支樣品，同一批次復溶混合后按文獻方法［16－17］分別進行免疫熒光和套式RT－PCR檢測，以CSFV兔化弱毒株作陽性對照，以PBS作陰性對照。

1．4 協作標定和定值 在本實驗室進行2次獨立試驗，同時將樣品分發至5家單位分別進行2次獨立試驗。將200905－1亞批血清不稀釋，200905－2亞批血清1∶4～1∶16倍比稀釋，200905－3亞批血清1∶400～1∶1600倍比稀釋，與等量稀釋至100 RID/mL的豬瘟兔化弱毒種毒混合，置15℃中和2 h，期間振搖 3次;同時設立種毒陽性對照(50 RID/mL)、陰性對照(3亞批血清的所有稀釋度)和空白對照(生理鹽水)。中和結束后，分別接種大耳白兔2只，每只耳緣靜脈接種1mL。按文獻方法［6］測溫和判定熱反應，并計算血清的中和效價。回收所有數據，用狄克遜(Dixon)法剔除數據中的異常值［11］，再用Excel 2010計算幾何平均數和標準差。

2 結果

2．1 物理性狀 所有安瓿內容物均呈灰白色團塊，加去離子水后在10 min之內溶解，溶解后為淡黃色澄明液體。

2．2 無菌檢驗、安全檢驗、支原體檢驗、真空度測定、均勻性檢驗、保存有效期試驗 結果均符合規定。

2．3 剩余水分測定 采用真空干燥法對抽取樣品進行了剩余水分測定，結果水分含量均低于4%(表1)。

表1 血清剩余水分含量 %

2．4 特異性檢驗 3亞批樣品經農業部獸醫診斷中心檢測，結果口蹄疫、偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病ELISA抗體均為陰性。除200905－1血清與種毒中和后引起家兔體溫反應外，200905－2、200905－3血清與種毒中和后均不引起家兔體溫反應。

2．5 殘余CSFV檢測 將樣品復溶后分別接種PK－15細胞并盲傳3代，再進行免疫熒光染色，結果均為陰性;將樣品復溶后進行套式RT－PCR核算檢測，結果均為陰性(圖1)。

圖1 套式RT-PCR擴增結果

2．6 協作標定 回收所有數據，分別計算血清效價，經狄克遜(Dixon)檢驗，所有數據均保留(表2)。

3 討論

兔體中和試驗影響因素較多，試驗結果易存在較大誤差，有時為獲得滿意結果不得不重復進行實驗。兔體中和試驗用豬瘟陰、陽性血清國家參考品的使用，則有助于使用單位控制和校準該試驗，分析和查找各自試驗的不穩定因素，提高該試驗的能力和水平。目前我國豬瘟活疫苗的效力檢驗是用兔體實驗測定兔體感染量來進行的，該試驗同樣易受人員、環境、動物等因素影響而存在較大誤差。若應用該參考品來測定疫苗的兔體感染量，則可以減少誤差或校準使用單位的檢驗體系。此外，該參考品也可以用于實驗室能力驗證或人員能力比對等。

表2 協作標定結果

［1］ Edwards S，Fukusho A，Lefèvre P C，et al．Classical swine fever:the global situation ［J］．Vet Microbiol，2000，73(2/3):103－119．

［2］ Domenech J，Lubroth J，Eddi C，et al．Regional and international approaches on prevention and control of animal trans boundary and emerging diseases［J］．Ann N Y Acad Sci，2006，1081:90 －107．

［3］ http://www．oie．int/eng/maladies/en_classification2010．htm?e1d7［2010 －1 －4］．

［4］ 中華人民共和國農業部．中華人民共和國農業部公告(第1125號)［S］．

［5］ 農業部第四屆獸用生物制品規程委員會．中華人民共和國獸用生物制品規程(2000年版)［M］．北京:化學工業出版社，2000．

［6］ 中國獸藥典委員會．中華人民共和國獸藥典(2010年版三部)［M］．北京:中國農業出版社，2010．

［7］ World Health Organization．Recommendations for the preparation，characterization and establishment of international and other biological reference standards(revised 2004)．WHO Technical Report Series，No．932，2006．

［8］ 全國標準物質管理委員會．一級標準物質技術規范(JJG1006－94)［S］．

［9］ VanderVeen A M H，Linsinger T P，Pauwels J．Uncertainty calculations in the certification of reference materials．2．Homogeneity study［J］．Accred Qual Assur，2001，6:26 －30．

［10］ Linsinger T P，Pauwels J，VanderVeen A M H，et al．Homogeneity and stability of referencematerials［J］．Accred Qual Assur，2001，6:20－25．

［11］全 浩．標準物質及其應用技術［M］．北京:中國標準出版社，2003．

［12］蔣子剛，顧雪梅．分析測試中的數理統計與質量保證［M］．上海:華東化工學院出版社，1991．

［13］ Kirkwood T B．Predicting the stability of biological standards and products［J］．Biometrics，1977，33(4):736 － 742．

［14］ Marina CR，Fernando RQ，Luis F，etal．Determination of product shelf life and activation energy for tumor necrosis factor－αin cerebrospinal for tumor necrosis factor－αin cerebrospinal fluid samples［J］．Clin Chem，1996，42(5):670 －674．

［15］ Peleg M，Normand M D，Corradini M G．The arrhenius equation revisited［J］．Crit Rev Food Sci Nutr，2012，52(9):830 －851．

［16］ 戴志紅，趙 耘，謝 磊，等．豬瘟病毒檢測技術規程［A］．獸醫微生物菌種資源標準化整理整合及共享試點項目組．獸醫微生物菌種資源描述規范及技術規程［M］．北京:中國農業科學技術出版社，2008．

［17］戴志紅，趙 耘，寧宜寶，等．豬瘟病毒FJFQ－39株的毒力鑒定［J］．中國預防獸醫學報，2008，30(9):694 －698．致謝:金宇保靈生物藥品有限公司趙丹彤、石寶蘭、關永梅、張慧芳、哈斯，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所劉景利、馬迪楊、李偉杰，福州大北農生物技術有限公司陳慶、張工，南京天邦生物科技有限公司侯軍、高云飛、陶慶園、代志新，廣西麗原生物股份有限公司黃慶南、肖華春等同志參與了協作標定，在此一并表示謝意!