穩健統計方法及t檢驗法在活菌計數能力比對中的應用

張 媛，張 磊，李 建，丁家波，李旭妮，劉軼秋，王 楠，徐 磊

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

活菌計數不僅是獸用生物制品檢驗中的一個重要檢驗參數，而且在臨床微生物檢驗中也會經常用到。為全面了解各檢驗員活菌計數的能力，促進各檢驗員提高細菌計數結果的準確性和有效性，探究方法間的結果差異，尋求更簡便、準確的計數方法，提高檢驗水平，中國獸醫藥品監察所組織8名檢驗員開展了細菌活菌計數人員比對及方法比對活動，以期為獸用生物制品行業開展能力比對活動提供有益的參考。

1 材料與方法

1．1 樣品的制備 制備大腸桿菌菌液、多殺性巴氏桿菌菌液及丹毒桿菌菌液，并制備普通瓊脂平皿、含0．1%裂解血細胞全血及4%胎牛血清馬丁瓊脂平皿、含10%胎牛血清馬丁瓊脂平皿各48付，待用。

1．2 比對的方法 常量稀釋法:吸取1 mL菌液，用適宜的稀釋液以1 mL+9 mL的方式連續10倍梯度稀釋6管，取第6管稀釋液以2 mL+4 mL的方式進行3倍稀釋，取稀釋后的菌液0．1 mL接種適宜的瓊脂培養基平板，3平板/樣。輕輕轉動平板，使菌液在瓊脂表面散布均勻。36～37℃培養適宜時間。

微量稀釋法:吸取100μL菌液，用適宜的稀釋液以100μL+900μL的方式連續10倍梯度稀釋6管，取第6管稀釋液以200μL+400μL的方式進行3倍稀釋，取稀釋后的菌液100μL接種適宜的瓊脂培養基平板，3平板/樣。輕輕轉動平板，使菌液在瓊脂表面散布均勻。36～37℃培養適宜時間。

1．3 結果的處理及評價方法的確立

1．3．1 人員比對 根據CNAS－GL02:2006《能力驗證結果的統計處理和能力評價指南》［1］中穩健統計方法，測定Z比分值，用于分析各檢驗員在總體檢測結果中所處的位置。Z比分值采用 X、XM、Norm IQR 來確定［2］。

Z比分值計算公式:Z=(X－XM)/Norm IQR，式中:Z為穩健比分值;X為檢驗數據;XM為中位值;Norm IQR為標準化四分位距，Norm IQR=0．7413×四分位間距(IQR)。

判定標準為:︱Z︱≤2為滿意結果;2＜︱Z︱＜3時，表示結果可疑;︱Z︱≥3為不滿意結果。1．3．2 方法比對 t檢驗是數理統計中一種檢驗平均值的檢驗方法，可用于檢查分析方法或操作過程是否存在較大的系統誤差。首先根據檢驗數據求出平均值x及樣本標準偏差S，將有關數據代入計算公式中計算t值。其次，根據選定的顯著性水準α=0．05及df值，由t分布表查得t臨界值。最后，將計算得到的t值與查表得到的t臨界值比較，如果前者小于后者，則認為二者之間無顯著性差異［3］。

t值計算公式［4］:

式中:x1－第一次檢驗測量數據的平均值;x2－第二次檢驗測量數據的平均值;s1－第一次檢驗測量數據的標準偏差;s2－第二次檢驗測量數據的標準偏差;n1－第一次檢驗測量的測量次數;n2－第二次檢驗測量的測量次數。

2 結果與分析

2．1 樣品均勻性保證 每個參比人員在相同環境下從同一細菌培養瓶中吸取菌液，同時進行操作，以保證比對樣品均一、比對條件一致。

2．2 各檢驗員活菌計算結果及統計分析

2．2．1 人員比對結果及統計分析 根據Z比分值計算公式，計算各參數值(常量法結果見表1、微量法結果見表3)及各參比人員每種樣品測定結果的Z值(常量法結果見表2、微量法結果見表4)。結果顯示，用常量法進行活菌計數，06號參比人員對大腸桿菌菌液和多殺性巴氏桿菌菌液檢驗結果︱Z︱為2．955和2．623，表示結果“可疑”，對丹毒桿菌菌液檢驗結果︱Z︱為3．523，結果“不滿意”;03號參比人員對多殺性巴氏桿菌菌液檢驗結果“可疑”，出現正偏差;其余6位參比人員用常量法對3種樣品的檢測結果︱Z︱均≤2，為“滿意”結果。用微量法進行活菌計數，只有兩名檢驗員對3種樣品的檢驗結果均為“滿意”，其余6名檢驗員均對1種或2種樣品出現了“可疑”或“不滿意”的檢驗結果。從Z比分值序列圖(圖1、圖2)可以更清楚地看出各參比人員之間檢測結果的比較情況。

表1 參比人員常量法檢測結果和Z比分值統計處理結果

表2 參比人員常量法檢測穩健統計參數

表3 參比人員微量法檢測結果和Z比分值統計處理結果

注:檢測值為檢測結果的對數值。

2．2．2 方法比對結果及統計分析 結果如表5所示。

表4 參比人員微量法檢測穩健統計參數

表5 三種樣品兩種方法活菌計數結果及統計分析

每種樣品均由8名參比人員在相同條件下，分別采用常量法和微量法進行測試。3種樣品的自由度 f均=n1+n2－2=14，經查 t值表，t臨界值均為t0．05(14)=2．145。多殺性巴氏桿菌菌液測定的t值為1．835＜t臨界值，這表明在 α=0．05顯著性水平時，兩種方法的檢測結果差異不顯著。大腸桿菌菌液和丹毒桿菌菌液測定的t值分別為2．860和3．619，均大于t臨界值，這表明在α=0．05顯著性水平時，兩種方法的檢測結果差異顯著。

3 討論

比對試驗是評價檢驗人員檢測能力與檢驗方法可靠性的一種有效手段。活菌計數結果不僅是判斷獸用生物制品質量是否合格的一個重要參數，也是臨床微生物檢驗的重要參考信息。由于影響檢驗員檢測結果的因素是多方面的，不同人員對同一樣品在同一時間、同一環境下的檢測數據也可能不盡相同，對于活菌附加量少的產品，不同檢驗人員給予的檢驗結論會出現合格與不合格質的區別。適當開展人員檢測能力比對活動能夠幫助檢驗員發現工作中存在的誤差，并采取相應的措施提高檢驗質量，從而達到不同檢驗人員檢驗質量相同，是實驗室質量管理體系中質量保證的重要環節。

此次活動發現3種樣品用常量法的檢驗結果均比用微量法的檢驗結果偏高，這可能是由于在用常量法進行檢驗時，吸管內的液體不是自然下流，而是將吸管內的菌液(包括管尖殘留的菌液)全部打入的原因。另外，多殺性巴氏桿菌菌液濃度低于大腸桿菌菌液和丹毒桿菌菌液，采用常量法和微量法對低濃度菌液進行活菌計數結果差異不顯著，對高濃度菌液進行計數結果差異顯著。在本次比對中對3種菌液進行活菌計數，常量法有6人結果︱Z︱均≤2，而微量法只有2人結果︱Z︱均≤2。用微量法進行檢驗，人員之間的差異更大，可能的原因包括部分檢驗員的移液器使用方法不規范，部分移液器未經標化，存在誤差。建議使用統一移液器及吸頭，統一操作手法及細節，規范移液器使用方法，以減少人為偏差。

由于暫無第三種方法驗證，本次比對未能確定采用常量法還是微量法進行活菌計數更接近待測樣品的真實值，需要更多的測試數據來反映兩種方法的系統誤差。在今后的工作中應建立標準操作規程，統一操作細節，規范操作手法，開展長期的、多次的比對活動，獲取更多實驗數據來比較常量法和微量法的優劣。

［1］ CNASGL 02:2006能力驗證結果的統計處理和能力評價指南［S］．

［2］ GB/T 15483．1－1999．利用實驗室間比對的能力驗證．第一部分:能力驗證計劃的建立和運作［S］．

［3］ 魯秀恒，孔憲忱．如何應用t檢驗正確評價糧油分析檢驗結果［J］．糧油倉儲科技通訊，1995，(1):37 －40．

［4］ 陳曉春，高金源．高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗病毒含量測定能力比對的實踐［J］．中國獸藥雜志，2012，46(2):5－9．