連翹顆粒劑的急性亞急性毒性試驗研究

吳 悅，陳儉清，趙玉蓮，李賢賢，李 鶴，李艷華

(東北農業大學動物醫學院，哈爾濱 150030)

連翹顆粒劑是針對現階段細菌的廣泛耐藥性［1，2］，而研制出的能減少耐藥性的中成藥制劑，具有清熱解毒之功效，主要用于預防和治療豬鏈球菌引起的疾病，有效的解決了豬鏈球菌耐藥性的問題［3－6］。其主要成分連翹是木犀科連翹屬［7］，具有抗菌、強心、利水、清熱解毒等功效。為了對連翹顆粒劑的安全性進行客觀評價，根據農業部新獸藥一般毒性試驗技術要求［8］，對其進行了急性毒性試驗和亞急性毒性試驗研究，為新藥的臨床階段提供理論依據。

1 材料

1．1 試驗動物 清潔級昆明系小鼠，體重在17～20 g之間，雌雄各半，雌性未產無孕，購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所。

1．2 試驗藥物及化學試劑 連翹顆粒劑，自行研制的耐藥抑制劑其主要成分是連翹酯苷。具有清熱解毒，散結消腫之功效，臨用前用蒸餾水配成相應的濃度;測定生化指標(GPT、GOT、AKP、肌酐和尿素氮)的試劑盒(批號:20111010)，南京建成生物工程研究所。

1．3 試驗儀器 BT224S型電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;7504型紫外分光光度計，上海精科實業有限公司;DK－8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司;TGL－16G離心機，湖南星科科學儀器有限公司;DH6000A型恒溫箱，天津市泰斯特儀器有限公司;光學顯微鏡等。

2 方法

2．1 急性毒性試驗 取20只小鼠隨機分為兩組，每組雌雄各半。試驗組一次性灌胃給藥100 g/kg(最大給藥劑量)，對照組灌以等容積的生理鹽水。連續觀察7 d。根據上下法［9］，找出0%和100%的死亡率的藥物濃度。

2．2 亞急性毒性試驗

2．2．1 動物分組及給藥劑量 將80只小鼠隨機分成四組，每組20只，雌雄各半。分別為連翹顆粒劑高劑量組、中劑量組、低劑量組和對照組，給藥劑量根據預試驗結果，按最大給藥量從高到低分別給藥為100 g/kg、33．3 g/kg、10 g/kg，對照組灌于等量的生理鹽水。用金屬灌胃器經口給藥，每天2次。試驗期間所有小鼠標準飲食，自由飲水。

2．2．2 檢測指標 分別在給藥的第7日和第14日時，對各組小鼠進行一般癥狀檢查。將小鼠斷尾采血，然后對其血液生理指標 (血紅蛋白、紅細胞、白細胞、白細胞分類計數)進行測定。將小鼠進行眼球采血后，分離血清，進行血液生化指標(GPT、GOT、AKP、肌酐和尿素氮)的檢測。

2．3 統計學處理 對一般癥狀檢查采用 t檢驗［10］方法進行統計學分析。血液生理生化試驗結果數據均采用平均值±標準差(X±s)的形式表示。用Spss17．0中One－way AVONA的LSD法進行差異顯著性分析。

3 結果

3．1 急性毒性試驗最大耐受量測定結果 當給藥量5000 mg/kg時，致死量仍然為0%，無法測出半數致死量(LD50)，因受試藥物的濃度或體積限制，只能測出最大耐受量。

以100 g/kg的藥物濃度給小鼠灌胃，給藥當天小鼠被毛光滑，有腹瀉癥狀，糞便呈黃褐色，采食、活動減少;第2日后小鼠采食量、活動量及糞便情況都恢復正常，與空白組無明顯差異。到第7日時，小鼠未出現死亡狀況。

3．2 亞急性毒性試驗結果

3．2．1 連翹顆粒劑對昆明系小鼠一般癥狀的影響

在試驗期間，均未發現有小鼠因藥物原因而出現的死亡狀況。試驗中各組小鼠的進食量、飲水量、精神狀況、被毛光澤度無異常變化。各組小鼠的體重均在正常范圍內變化。結果表明各組差異不顯著，見表1。

3．2．2 連翹顆粒劑對昆明系小鼠血液生理指標的影響

連翹顆粒劑對昆明系小鼠生理指標的影響結果見表2。3個劑量組的血紅蛋白、紅細胞數、白細胞數、淋巴細胞百分比、中性粒細胞百分比與對照組間差異均不顯著(P＞0．05)。紅細胞計數各組14 d比7 d相比較，除高劑量組外其他三組的值略有升高，其中中低劑量組增加幅度較大。白細胞計數7 d和14 d各組比較變化均不明顯，14 d與7 d各劑量組相比較均有不同程度的降低。淋巴細胞百分比和中性粒細胞百分比在第14日時都比第7日時有較大幅度的增加。血紅蛋白在第14 d時除高劑量組降低外，其他三組均有不同程度的增加。

表1 連翹顆粒劑對昆明系小鼠體重的影響(n=20)

表2 連翹顆粒劑對昆明系小鼠血液部分生理指標的影響(X ±s，n=20)

3．2．3 連翹顆粒劑對昆明系小鼠生化指標的影響連翹顆粒劑對昆明系小鼠生化指標的影響結果見表3。第7日高劑量組的GOT值高于其他三組，在第14日時高劑量組的GOT與對照組差異顯著(P＜0．05);在第14日，各組的GPT均有不同程度的增加;除中劑量組的CR值減少，其他三組的CR值有增加;BUN的值均有不同程度的增加，其中對照組和中劑量組的增加幅度較大;空白組和高劑量組的AKP增加，而中低劑量組的AKP減少。除第14日的GOT高劑量組與對照組差異顯著(P＜0．05)外，其他各組的各項指標均差異不顯著(P＞0．05)。

表3 連翹顆粒劑對昆明鼠部分生化指標的影響(X ±s，n=20)

4 討論

連翹顆粒劑為自主研發的耐藥抑制劑，主治豬鏈球菌引起的相關疾病。連翹顆粒劑是向連翹提取物中加入乙醇，經濾過、回收、濃縮等步驟后，加入糊精和糖粉所得到的混合物制備成顆粒狀所制成的［11－12］。連翹是我國傳統中藥，已被載入藥典，用于治療風熱感冒、高熱煩渴等癥狀，但目前，連翹在用于動物疾病的防治方面的研究較少［13］。所以連翹顆粒劑的研發，目的是要解決由豬鏈球菌所引起的相關疾病的耐藥性問題。

從連翹顆粒劑的急性、亞急性毒性試驗結果分析，在用藥期間各劑量組的昆明系小鼠均未出現因藥物原因而死亡的情況。根據新獸藥一般毒性試驗技術要求，短期給予藥物毒性較低，比較安全。在試驗期間，小鼠的體重均有不同程度的增加。各劑量組之間差異不顯著，表明藥物對小鼠的食欲及健康狀況沒有影響。

血液生理指標是檢驗藥物毒性的很重要的指標，試驗結果表明，紅細胞數、白細胞數、中性粒細胞數和淋巴細胞數、血紅蛋白的含量與對照組比較差異均不顯著，故判斷藥物的毒性低。已有研究表明，根據化學物急性毒性(LD50)劑量分級表，連翹酯苷分級為低毒［14］。而連翹酯苷不止對實驗動物本身，對胚胎、胎兒和致畸性也均無明顯毒性［15］。由此可見，連翹酯苷作為連翹顆粒劑的主要成分，在以往的實驗中證實了其低毒安全的特性。

血液生化指標是測定藥物對肝腎的毒性作用，本試驗結果表明，除第14日的谷草轉氨酶(GOT)測定項的高劑量組出現了差異顯著(P＜0．05)外，其他各劑量組的血液生化指標均無明顯差異。因轉氨酶是反映肝臟功能的重要指標，且只有肝臟受到嚴重傷害時谷草轉氨酶才會出現偏高，可以看出，長期服用高濃度的該藥物對肝臟有一定的損害，但中、低劑量組與對照組相比差異不顯著，說明中、低劑量比較安全。

研究發現連翹酯苷在體內外實驗中對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌均有較好的抑制作用［16－17］，應用前景廣泛。近期研究表明，連翹中苯乙醇苷類成分具有較強抗菌活性，在評價連翹及其以抗菌為主要功效的制劑質量時，以連翹酯苷作為主要特征成分比連翹苷更合適［18］，但其抗菌作用機制有待于進一步的研究。

［1］ 鄭 璇，鄭育洪．國內外超級細菌的研究進展及防控措施［J］．中國畜牧獸醫文摘，2012，1(28):69 －75．

［2］ 李明雁，王 敏，崔 琳，等．阿莫西林－泰樂菌素復方藥物的安全性試驗［J］．中國獸醫雜志，2010，46(9):66 －68．

［3］ 邊 棟，崔 陽，崔 琳，等．連翹－阿莫西林的急性亞急性毒性試驗［J］．中國獸醫雜志，2010，46(6):47 －48．

［4］ 周德剛，張曉會，劉興金，等．雙黃連口服液的急性毒性試驗研究［J］．中國獸藥雜志，2011，45(12):29 －30．

［5］ 唐一鳴，姜中其，陳 儉．乳酸恩諾沙星對小鼠的急性毒性試驗［J］．中國獸藥雜志，2010，44(4):29 －30，60．

［6］ 張東玲，張秀英，陳曉霞．中藥復方口服液的急性毒性與蓄積性毒性實驗研究［J］．中國獸藥雜志，2007，41(7):16 －18．

［7］ 中國獸藥典委員會．中華人民共和國獸藥典2010年版［S］．

［8］ 中華人民共和國農業部．新獸藥一般毒性試驗技術要求［S］．

［9］ 國家食品藥品監督管理局·化學藥物指導原則(藥理毒理部分各論)GPT1－1，化學藥物急性毒性試驗技術指導原則［S］．

［10］謝 莊．獸醫統計學［M］．北京:高等教育出版社，2005．

［11］李艷華．連翹顆粒劑的制備方法［P］．中國:CN101653481，2010－02－24

［12］劉 遜，陳儉清，李明雁，等．星點設計－效應面法優化連翹顆粒劑的制備工藝研究［J］．東北農業大學學報，2012，43(6):130－133

［13］劉世旺，徐艷霞，鄭永良．連翹乙醇提取物對細菌生長曲線的影響［J］．安徽農業科學，2007，35(24):7383 －7384．

［14］毛東有，張中文，楊 明，等．連翹酯苷對小鼠的急性毒性及體內誘生IFN－α 的研究［J］．動物醫學進展，2009，30(6):15－17．

［15］朱江波，邱建平，朱玉平，等．連翹酯苷凍干粉對SD大鼠的致畸作用［J］．中國新藥雜志，2008，17(7):570 －573．

［16］王宏軍，蔣 紅，吳國娟．連翹酯苷在體外與體內的抑菌效果研究［J］．中國飼料，2005，10:26 －27．

［17］馮淑怡，李先榮，孫建寧．連翹酯苷抗感染、解熱作用研究［J］．現代生物醫學進展，2006，6(10):73 －75．

［18］劉 明．中藥連翹藥理作用的研究近況［J］．現代醫藥衛生，2007，23(16):2438 －2439．