超高效液相色譜－串聯質譜法測定雞肉和牛肉中五種常用抗球蟲藥

李 丹，孫 雷，畢言鋒，徐 倩，王鶴佳，徐士新

(中國獸醫藥品監察所 國家獸藥殘留基準實驗室，北京 100081)

球蟲病是由一種單細胞原蟲進入腸道而引起的一類流行病，在畜禽球蟲病中，以雞、兔、牛和羊的球蟲病危害最大［1］。氯苯胍、常山酮、氯羥吡啶、氨丙啉均屬于化學合成類抗球蟲藥物(結構式見圖1)，乙氧酰胺苯甲酯屬于抗球蟲藥增效劑，與多種抗球蟲藥聯合使用，這五種藥物對于多種球蟲病均有良好的治療效果。由于不規范使用，抗球蟲藥若長期、持續添加在飼料中，極容易造成藥物在肉及蛋品中出現殘留，危害人體健康。我國農業部235號公告中嚴格規定此五種抗球蟲藥在牛、雞肌肉中的最高殘留限量范圍為10～500μg/kg。文獻中，采用HPLC及LC－MS/MS測定動物性組織中氨丙啉、常山酮、氯苯胍等單一藥物的報道較多，但對動物性組織中氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五種藥物同時檢測的殘留檢測方法報道文獻較少。本研究擬采用LC－MS/MS方法建立雞、牛肌肉中氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五種藥物的多殘留檢測方法，以期為該類藥物的殘留監控提供科學依據。

圖1 氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍的化學結構式

1 材料與方法

1．1 儀器 ACQUITY UPLC－Quattro Premier XETM質譜聯用儀，Waters公司;AE260電子天平，Mettler Toledo公司;Biofuge Strators高速冷凍離心機，賀利氏公司;Organomation Associates氮吹儀，Jnc公司;SIR4漩渦混合器，IKA公司。

1．2 試劑與材料 對照品:氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍，純度均大于95．0%，Dr．Ehrenstorfer EmbH 公司;乙腈、甲醇為色譜純，Fisher公司;乙酸銨為分析純;正己烷為分析純;所用水為超純水。

1．3 標準儲備液和工作液的配制 稱取氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍對照品適量，精密稱定，分別置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標準儲備液;分別精密量取五種標準儲備液適量，置同一10 mL棕色量瓶中，用甲醇逐步稀釋成適宜濃度的混合標準工作液。

1．4 標準曲線繪制 精密量取適量混合標準工作液，用 50% 甲醇稀釋成濃度均為 10、50、100、200、500 ng/mL的系列混合對照溶液，量取5種濃度的混合對照溶液各1．0mL，分別用于溶解預先按提取凈化吹干后的殘留物，按照樣品前處理方法處理后作為基質匹配系列混合對照溶液，從低濃度到高濃度測定，每一濃度進樣3針，以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1．5 UPLC－MS/MS分析條件 色譜條件:色譜柱為 BEH C18色譜柱(50 mm ×2．1 mm，1．7 μm);流動相A相為乙腈，B相為20 mmol/L乙酸銨水溶液，梯度洗脫:0～4 min，5%A線性變化至100%A;4～5 min，100%A 線性變化至 5%A;5～6．5 min，維持5%A。流速0．3 mL/min，柱溫30℃，進樣量10 μL。

質譜條件:電噴霧離子源(ESI+)，毛細管電壓為3．2 kV，萃取電壓為3V，RF透鏡電壓為1V，源溫110℃，脫溶劑溫度350℃，脫溶劑氣速650 L/h，錐孔反吹氣速50 L/h。多反應監測各藥物離子對及對應的錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表1 5種藥物的定性、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量

1．6 樣品前處理 準確稱取絞碎后的(2±0．05)g試料，置于50mL離心管內，加乙腈8mL，渦旋混合30 s，中速振蕩5 min，8000 r/min離心5 min后，上清液置于另一50 mL離心管內，殘渣重復提取一次。合并兩次上清液，混勻后取出8 mL置于玻璃管中，于50℃水浴中氮氣吹干。殘余物用50%甲醇水溶液1．0 mL溶解，再加50%甲醇水溶液飽和的正己烷1．0 mL，渦旋混合30 s，靜置分層后，轉移下層溶液至1．5 mL塑料離心管內，于 －4℃下13000 r/min離心10min后，吸適量下層溶液過0．2 μm濾膜后，供液相色譜－串聯質譜儀分析。

1．7 方法學考察

1．7．1 方法靈敏度確定 將適量混合標準溶液加入到空白組織中，經上述方法進行前處理后，用UPLC－MS/MS檢測，觀察藥物特征離子質量色譜峰信噪比(S/N)和對應藥物濃度，S/N＞3，定為方法的檢測限;S/N＞10，定為方法的定量限。

1．7．2 準確度和精密度的測定 采用標準添加法，在空白組織中添加低、中、高三個不同濃度混合組分進行回收率試驗;各濃度進行6個樣品平行試驗，重復3次，求批內、批間RSD。

2 結果與討論

2．1 流動相的選擇 本研究通過優化流動相改善五種藥物的分離效果。分別試驗了甲醇－0．1%甲酸水溶液、乙腈－0．1%甲酸水溶液、0．1%甲酸乙腈－0．1%甲酸水溶液、乙腈－20 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相，結果表明，含有乙腈的流動相均優于含有甲醇的流動相，流動相中加入乙酸銨后，分離效果更好。因此，本方法以乙腈－20 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相進行梯度洗脫。

圖2 空白牛肌肉特征離子質量色譜圖

2．2 前處理條件的優化 氨丙啉、氯羥吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五種抗球蟲藥均屬于弱堿性化合物，易溶于酸性水溶液和極性有機溶劑。已報道的提取用溶劑有乙酸乙酯［2］、磷酸鹽緩沖液［3］、乙腈等;用液液萃取、固相萃取等方法凈化，用到的固相萃取柱有 HLB柱［4－5］、堿性氧化鋁柱［6－7］等。經過優化處理，本方法采用乙腈進行提取，再用正己烷去除脂肪等雜質，使得這五種藥物獲得較高的回收率，且前處理過程簡單，省去了采用固相萃取柱凈化的步驟。

2．3 方法線性 5種藥物混合標準工作液在10～500μg/L的系列基質校準標準溶液范圍內，呈良好線性關系，標準曲線及相關系數見表2。

表2 5種藥物的標準曲線及相關系數

2．4 方法靈敏度、回收率和精密度 采用空白組織中添加目標化合物的方法，得出5種藥物在樣品中的檢測限均為5μg/kg，定量限均為10μg/kg。牛肌肉基質空白色譜圖見圖2，100μg/kg空白牛肉基質匹配試液和100μg/kg空白牛肉添加試液中5種藥物的特征離子質量色譜圖見圖3、圖4。

圖3 100μg/kg空白牛肌肉基質匹配試液中五種藥物的特征離子質量色譜圖

圖4 100μg/kg空白牛肌肉添加試液中5種藥物的特征離子質量色譜圖

在空白牛、雞肌肉中添加100、200、500μg/kg三個不同濃度的5種混合組分進行回收率試驗，結果匯總見表3。可以看出，5種藥物在空白牛、雞肌肉中的平均添加回收率為75．4% ～109%，批內批間相對標準偏差均小于15%。

3 結論

本研究利用超高效液相色譜－串聯質譜法(UPLC－MS/MS)同時測定雞肉和牛肉中5種常用抗球蟲藥物，方法線性、靈敏度、回收率和精密度等參數均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。

表3 空白牛肉、雞肉中添加5種抗球蟲藥的回收率和精密度實驗結果

［1］ 陳杖榴．獸醫藥理學［M］．北京:中國農業出版社，2002:283．

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