端粒酶在細胞永生化中的應用

陳小云，張 敏，王 磊，張啟龍，王 棟，蔣桃珍

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

細胞永生化(cell immortalization)指體外培養的細胞經過自發的或受外界因素的影響從增殖衰老危機中逃離，從而具有無限增殖能力的過程。自然界中自發永生化的幾率非常小，嚙齒類動物為10－5～10－6，而人類細胞則小于 10－12［1］。細胞永生化與端粒(telomere)和端粒酶(telomerase)有密切聯系。端粒除保持染色體完整性外，還作為細胞生存期限的關鍵性調控因子存在，端粒功能障礙會導致細胞增殖衰竭或凋亡。

端粒酶的催化亞單位端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)在端粒酶的激活中起著關鍵作用。目前，應用端粒酶來延長細胞的生命期是近年來的研究熱點之一。相對于病毒、原癌基因等永生化基因，TERT具有許多優越性。端粒酶轉染建立的永生化細胞保持了正常細胞的生理特性，具有正常的生長速率，正常的核型，呈現生長錨著依賴性和接觸生長抑制性，因而是一種非常理想的細胞來源［1］。

1 端粒和端粒酶

端粒是位于真核細胞線性染色體末端的特殊結構，由簡單的DNA串連重復序列和一系列相關的蛋白質組成，即DNA蛋白復合物。端粒DNA由若干個不含功能基因的簡單重復的非編碼序列構成。端粒的兩條DNA鏈長度也不一樣，以人為例，其中具有一條單鏈富含GT，比它的互補鏈富CA單鏈多出50～400個核苷酸。

端粒酶是一種合成和延伸端粒的核糖核蛋白。正常細胞內檢測不到端粒酶活性，因此正常細胞分裂次數是有限的，不能無限增殖。但是惡性腫瘤細胞的增殖并不使端粒區縮短，因此具有無限增殖的能力，這是因為細胞中端粒酶被激活［2］，它的作用在于補充細胞分裂中丟失的端粒，維系細胞穩定。

端粒酶由三部分組成:端粒酶RNA(telomerase RNA，TR或TRC)模板、端粒酶相關蛋白(TPI)和TERT。TERT的表達水平高低決定端粒酶活性，被認為是調節端粒酶活性的重要限速步驟之一。TERT在進化上相對保守，幾乎所有物種均含有6個逆轉錄酶元件和1個端粒酶特異性元件。對人、雞、猴、大鼠、倉鼠、蟾蜍等6個不同物種TERT的基因序列比較可以發現，其功能元件是相對保守的(圖1)。在原代培養的細胞中穩定表達人端粒酶催化亞基(hTERT)基因能穩定端粒的長度，使細胞易于永生化，因此hTERT的激活是細胞永生化的重要步驟。

圖1 不同物種的TERT基因比較

2 端粒酶在細胞永生化中的應用

2．1 端粒酶的優越性 到目前為止，采用傳統方法已經構建了許多種永生化細胞系，但是各種細胞永生化的方法都有著顯著的局限性。它們往往出現有別于正常細胞的特征，如細胞形態改變、核型改變、具有致瘤性;另外，有些細胞的生長失去接觸性抑制，成為轉化細胞。而TERT介導的永生化細胞是正常細胞，而非轉化細胞。研究表明，它們具有正常生長率、核型，呈現接觸抑制和錨著依賴性，不具有致癌性和軟瓊脂克隆形成能力等［4］。其次，TERT介導的永生化細胞已通過了M1期和M2期，同生殖干細胞一樣，是真正意義上的永生化。

hTERT－永生化細胞兼具原代細胞的原始特性，以及傳代細胞系的連續培養能力。在獲得兩種類型細胞優點的同時，避免了它們的缺陷。表1中，對常見的四種細胞類型的特性進行了簡要比較。

表1 四種細胞類型的特征比較

2．2 端粒酶在人類細胞永生化中的應用 1998年，Bodnar等［5］首先將外源性hTERT導入人視網膜色素上皮細胞和包皮成纖維細胞獲得成功。后續研究發現，此類細胞可持續增殖，至少達未轉染細胞PDs的2～3倍。Wieser等的研究結果表明，外源表達hTERT即足以使腎近端小管上皮細胞永生化，永生化細胞的各項表型與原代細胞一致，經過連續90次群體倍增后，轉化細胞依然保持良好的遺傳穩定性［6］。美國Clontech與Geron公司合作推出第一種商品化的永生化正常細胞系hTERTRPE1，其較正常細胞增殖快，平均每周達5－6 PDs，其傳代多于150代，其中有3個克隆多于300代［7］。

全球最大的生物材料資源中心美國典型培養物保藏中心(ATCC)也致力于人類細胞的hTERT永生化細胞系的構建。目前已構建了10余種hTERT永生化細胞系，并實現了商品化。同時，ATCC還發布了hTERT永生化細胞系的質量控制標準，包括TRAP試驗檢測hTERT活性、核型分析、免疫化學和細胞特定標志的流式細胞術等，以保證細胞質量始終處于良好的可控狀態。

國內研究者也在hTERT永生化人類細胞系方面進行了一些研究。如呂麗萍［8］將編碼hTERT的基因轉入成人肝細胞，篩選出了經 hTERT修飾后的成人肝細胞，細胞株可連續傳代培養。與原代成人肝細胞相比，轉化細胞對HBV的易感性未見明顯改變。

2．3 端粒酶在哺乳動物細胞永生化中的應用 來源于靶宿主組織的原代動物細胞，是病毒增殖的最理想工具。盡管極少的原代細胞可自發永生化，但是其基因型不穩定，甚至與原代細胞表型存在較大差異。例如有研究者采用SV40病毒，使豬肺泡巨噬細胞(PAM)永生化，但永生化細胞不支持豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的復制［9］。進一步的研究發現，這些細胞均不能表達PRRSV進入細胞的受體 pCD163［10］。這一研究也進一步證實了病毒轉化細胞，可能會導致原代細胞表型的改變。

因此，研究者們轉而采用表達hTERT轉化的方法，使原代細胞永生化。如針對采用病毒永生化PAM 出現的問題，Sagonga等［11］將 hTERT cDNA 轉染PAM細胞，穩定轉染細胞能組成型表達hTERT蛋白，使細胞永生化。該PAM永生化細胞未影響細胞表面CD163受體的表達水平。因此，這一新型細胞系有利于PRRSV病毒的分離和增殖，并可作為病毒致病性和免疫功能研究的有效工具。

除了PAM外，其它豬的原代細胞，也有成功采用hTERT獲得永生化的報道。例如Sabine等采用hTERT基因轉染技術，獲得了永生化的豬輸卵管上皮細胞系TERT－OPEC，該細胞具有端粒酶活性，并與上皮細胞標志物角蛋白具有免疫反應［12］。

潘小平等［13］將含hTERT真核表達的載體轉染到原代豬肝細胞，經G418篩選，獲得耐藥性的豬肝細胞克隆并傳代3代。原代細胞和轉化細胞培養上清中分泌白蛋白和尿素氮在前3天無統計學差異(P ＞0．05)。此后，有研究者［14］將編碼 pCI－neo－hTERT真核表達質粒導入原代培養的豬小腸上皮細胞，得到抗G418陽性細胞群，并傳至80代。

Pamela等［15］發現對于驢、普通斑馬和細紋斑馬等3種馬屬動物，僅表達外源hTERT尚不足以使其原代成纖維細胞永生化。但是，若同時表達hTERT和hTERC，則可檢測到端粒酶活性以及端粒的延長，并能使3種動物的原代成纖維細胞細胞永生化。

現有的研究結果表明，將hTERT轉入牛的體細胞和胚胎細胞，能延長其端粒長度，并增強端粒酶活性。對于牛源原代細胞，有報道稱僅轉化hTERT，就能使牛毛細管內皮(BCE)細胞通過衰老期，獲得永生化。令人費解的是，盡管轉化細胞可檢測出很高的端粒酶活性，但這些穩定轉染的細胞，端粒的長度卻隨著細胞傳代而逐漸縮短［16］。后來，Wiebke等將hTERC和hTERT表達質粒，分別注射至牛囊胚細胞，發現外源表達hTERC能增加牛囊胚細胞的端粒酶活性和端粒長度;而且共表達hTERT和hTERC組，與單獨表達hTERC組相比，端粒的長度沒有增加［17］。以上結果表明，TERC是牛囊胚細胞端粒酶活性的限速因素之一。

對于山羊的原代細胞，國內也有一些成功的報道。例如楊艷將hTERT基因導入山羊卵巢間質原代細胞，建立了永生化山羊卵巢間質細胞系。轉染細胞系無致瘤性轉化，同時保持了正常細胞的生物學特性［18］。隨后，趙曉娥等［19］用將 hTERT 基因轉染到山羊胎兒成纖維細胞中，結果外源性hTERT基因可以延長胎兒成纖維細胞在體外培養的壽命，降低細胞凋亡率。

此外，在永生化鼠類細胞方面，目前已有大量成功的報道。最近，對于鼠的骨髓間充質干細胞［20］和造骨細胞［21］等原代細胞的永生化又取得了成功。

2．4 端粒酶在禽類動物細胞永生化中的應用hTERT在永生化禽類原代細胞方面，很少有成功的報道。最早的報道是Georgios等(2005)將hTERT轉染雞胚成纖維細胞(CEF)，在轉染的CEF中檢測到hTERT表達，卻沒有檢測到端粒酶活性或穩定的端粒長度，并且轉染的CEF與正常CEF經歷同樣世代后開始衰老凋亡［22］。

隨后，有研究者對這一問題進行了更深入的研究，他們構建了多種chTR的表達載體，轉染CEF細胞。結果可以檢測到chTR的表達，并伴隨著內源chTERT的表達。但是在這些轉染的CEF細胞中端粒酶活性未持續存在［23］。這一結果提示，CEF細胞中可能缺少某些端粒保護蛋白的支持。

國內也有一些相關的研究報道。如孫瑩等檢測了雞胚成纖維細胞(CEF)和馬立克氏淋巴瘤細胞系(MDCC－MSB1)的端粒酶活性，發現chTERT是端粒酶活性的主要限速步驟之一，也可能是導致馬立克氏病淋巴瘤的重要因素［24］。還有研究人員構建了hTERT基因真核表達載體并轉染CEF，轉染后可觀察到綠色熒光［25］。但是，這一研究在近三年來均未見后續報道，因此，不能確定是否會如上文中Georgios等報道的那樣，在轉染的CEF中檢測到hTERT表達，卻沒有檢測到端粒酶活性或穩定的端粒長度。

雖然目前還未見采用hTERT成功永生化CEF的報道，但是，在雞的羽髓干細胞卻有成功的先例。徐玉林將hTERT轉染羽髓干細胞獲得穩定傳代的細胞，檢測到端粒酶的活性。永生化細胞具有較強的生命活力，并仍然保留正常的生物學特性［26］。

3 端粒酶在傳代細胞系中的應用

Crea等于2006年首次報道了hTERT對永生化細胞體外培養特性的影響，過量表達hTERT的永生化中國倉鼠卵巢細胞系CHO K1在批次培養中的細胞凋亡明顯減少、活細胞密度顯著提高、培養時間明顯延長［27］。這一研究結果為組成型過量表達hTERT能有效地改善永生化細胞的生長特性、提高細胞培養效率提供了肯定的依據。

劉紅等研究發現，hTERT組成型過量表達可降低Vero細胞的貼附生長依賴性和對血清的依賴程度，是有應用潛力的改良哺乳動物細胞體外培養性狀的技術途徑［28］。

hTERT－永生化技術，還可用于細胞系基因功能研究。例如，有研究者將野生型和間隙連接蛋白基因43(Cx43)缺失型鼠的造骨細胞系，采用hTERT－永生化后進行研究，明確了Cx43在早期分化和礦化階段的作用［29］。

4 問題與展望

從目前的研究結果來看，細胞永生化過程中端粒的維持并非全部依賴于端粒酶的激活，約有30%的永生化人細胞系并不表達端粒酶。在一段時期內，研究者們一直試圖解釋這部分細胞在不表達端粒酶活性的情況下，如何保持甚至是延長端粒的長度，并提出了多種假說。2012年science雜志上發表了一篇論文，對此進行了解釋，指出10－15%的人類癌細胞并不表達端粒酶的活性，而是利用端粒替代延長(ALT)機制，該機制不同于通常采用的通過端粒酶延長端粒的機制［30］。

盡管雞的端粒酶活性重建取得了一定進展，但是目前尚未見到利用chTR和chTERT建立雞的永生化細胞的報道，有些問題仍有待進一步探索和研究。相信隨著研究的不斷深入，鳥類的端粒生物學將被完整地闡明，將為人類最終闡明衰老和癌癥等疾病的發生機制奠定基礎。

另外，并非所有類型的細胞都能通過這種方法建立永生化細胞系，甚至對于同一種細胞，不同的研究得到不同的結果。細胞永生化雖是目前細胞生物學研究的熱點之一，但有許多問題尚未解決，如細胞的衰老機制、一些細胞循環的分子機理以及對不同的細胞采用何種永生方法等方面還有待研究。這些問題的闡明，有利于了解細胞增殖與衰老的分子機制，為治療腫瘤、控制腫瘤細胞增殖以及器官移植奠定堅實的基礎。

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