氫自養高氯酸鹽還原菌培養馴化的研究*

高孟春，李亞惠，張 優，張 健，任 云，趙從從

（中國海洋大學1.海洋環境與生態教育部重點實驗室；2.環境科學與工程學院，山東 青島266100）

高氯酸鹽是1種具有高度擴散性的持久性有毒污染物，被廣泛地應用在軍工生產、煙火工業、皮革加工等領域。一旦高氯酸鹽排入水體后，由于其具有化學性質穩定和水溶性高的特點，在自然水系中流動性很強，能持續遷移造成大范圍的地表水和地下水污染［1－2］。人體攝入高氯酸鹽后，它能干擾甲狀腺素的合成和分泌，影響人體正常的新陳代謝［3－4］。高氯酸鹽去除技術主要有離子交換法、膜分離法和生物還原法。離子交換法［5］和膜過濾法［6－7］能有效地去除水中高氯酸鹽，但存在高濃度高氯酸鹽的再生液或濃縮液需后續處理的問題。生物還原法是指在缺氧條件下通過高氯酸鹽還原菌將高氯酸鹽還原為無毒的，是一種經濟、有效和安全的高氯酸鹽去除技術。根據電子供體和碳源的不同，高氯酸鹽還原菌可分為異養微生物和自養微生物。異養高氯酸鹽還原菌以有機物作為碳源和電子供體，而自養高氯酸鹽還原菌以無機碳作為碳源，用S0、Fe0、H2和S2O2－3等作為電子供體。與異養高氯酸鹽還原菌相比，自養高氯酸鹽還原菌具有污泥產量低、不需添加有機碳源的特點，出水中有機物及微生物產物含量較低。以H2作為電子供體還原高氯酸鹽的研究結果表明［12－13］，氫自養還原高氯酸鹽具有較好的處理效果。其中，氫自養高氯酸鹽還原菌是完成微生物還原高氯酸鹽的關鍵。但是，目前開展氫自養高氯酸鹽還原菌培養馴化的研究相對較少。本文分別以厭氧污泥作為接種污泥和氫氣作為電子供體，系統地研究了氫自養高氯酸鹽還原菌的培養馴化過程，研究成果可為氫自養還原高氯酸鹽反應器提供高效的氫自養高氯酸鹽還原菌。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

接種污泥取自青島市李村河污水處理廠的厭氧消化污泥。培養基由基礎培養基、微量元素和磷酸鹽緩沖液組成。基礎培養基和微量元素組分分別見表1和2。磷酸鹽緩沖液（20mmol／L，K2HPO3∶KH2PO3＝1∶1）確保體系中pH值穩定。

表1 基礎培養基組成Table 1 Composition of basic medium

表2 微量元素組成Table 2 Composition of trace elements ／g·L－1

1.2 分析方法

2 培養馴化過程

本研究采用周期運行培養方式，同時進行3個平行試驗。將從污水處理廠取回的厭氧污泥靜置5h后棄去上清液，厭氧污泥的 MLSS為17.06g／L，取50mL注入500mL的厭氧瓶中，加入經N2／CO2混合氣（N2∶CO2＝4∶1，V∶V）脫氧的250mL營養鹽溶液。厭氧瓶中最初的濃度約為300mg／L，調節pH約為7.2，通入N2／CO2混合氣體3min，排除其上部空間的氧氣后，立即用丁基橡膠塞封住瓶口，再用鋁封進一步密封。用注射器抽空反應器內液面上部的N2／CO2混合氣體，將氫氣發生器產生的H2（100mL／min）通過不銹鋼針向反應器內注入直至飽和（約3min），保證厭氧瓶的上部空間充有一定量的氫氣。將封裝好的厭氧瓶固定于25℃恒溫搖床中培養，振蕩頻率為120r·min－1。培養馴化過程中定期取樣分析厭氧瓶中、、Cl－、pH、污泥濃度及微生物群落結構變化。當培養馴化周期穩定在一定值時，氫自養高氯酸鹽還原菌培養馴化過程結束。

3 結果與討論

3.1 培養馴化過程中濃度的變化

培養馴化過程中，厭氧瓶中高氯酸鹽的起始控制濃度約為300mg／L，在厭氧條件下氫自養高氯酸鹽還原菌以H2作為電子供體將高氯酸鹽先還原為次氯酸鹽和亞氯酸鹽，最終還原為無毒的Cl－和O2，不同的培養馴化周期的濃度變化如圖1所示。

圖1 培養馴化過程中ClO－4濃度及去除率的變化Fig.1 Change of ClO－4concentration and removal efficiency during the enrichment and cultivation

3.2 培養馴化過程中pH的變化

培養馴化氫自養高氯酸鹽的適宜pH值為7左右。本研究采用磷酸鹽緩沖液確保體系中pH值穩定，每個馴化周期初期pH值調至7.2左右，不同的培養馴化周期Cl－的濃度變化如圖2所示。

圖2 培養馴化過程中pH的變化Fig.2 Change of pH during the enrichment and cultivation

由圖2可知，在不同培養馴化周期內厭氧瓶反應體系中均出現了pH的上升，且培養馴化周期時間越長，pH上升幅度越大。第1培養馴化周期內，反應體系pH由最初的7.2逐步上升到8.7，但試驗中及時更換培養基因，沒有造成pH過高現象。第2培養馴化周期縮短至4天，反應體系pH由最初的7.3升至7.8。隨著培養馴化時間的增加，每個馴化周期內反應體系pH上升幅度繼續減小，反應體系pH穩定在7.1～7.6，滿足氫自養高氯酸鹽生長、發育和繁殖的條件。

3.3 培養馴化過程中污泥濃度的變化

污泥濃度以蛋白質濃度表征，不同的培養馴化周期蛋白濃度的濃度變化如圖3所示。由圖3可知，在整個培養馴化過程中厭氧瓶反應體系中蛋白質含量由最初的156mg／L到第8培養馴化周期末降至102mg／L，馴化后期有所上升，培養馴化結束時含量為117mg／L。在以厭氧泥為接種泥的氫自養高氯酸鹽還原菌馴化過程中，馴化初期剛接種的污泥中有一部分細菌因不適應環境而被淘汰，馴化后期反應體系內氫自養高氯酸鹽還原菌得到增殖，富集產生氫自養高氯酸鹽還原菌污泥沉降性能較好，且具有較高的高氯酸鹽還原活性。

圖3 培養馴化過程中蛋白質含量的變化Fig.3 Change of protein content during the enrichment and cultivation

3.4 培養馴化過程中微生物群落結構的變化

3.4.1 DNA提取與PCR擴增 為了系統地研究厭氧污泥培養馴化過程中微生物群落結構的演替變化，分別從厭氧接種污泥和第8、24和45天的樣品中提取DNA，對應的編號分別為1、2、3、4，將樣品的 DNA提取結果，與λ－Hind III digest DNA Marker相對照，其分子量在23kb左右，與細菌基因組的大小相同，所提DNA為較完整的細菌基因組DNA。與Marker相比，目標條帶較清晰，亮度和純度較好，沒有出現明顯的拖帶現象，無短片段出現，說明已經獲得了較完整的微生物總DNA且適宜于PCR擴增反應。將提取的DNA梯度稀釋后進行16srDNA片段PCR擴增。擴增產物的凝膠電泳圖如圖4所示。

圖4 培養馴化過程中污泥樣品PCR擴增產物電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified 16SrDNA during the enrichment and cultivation

由圖4可知，4個樣品均得到良好的擴增效果，條帶清晰且無非特異性擴增。與DL2000DNA Marker（M）對照發現，條帶的亮度較好，且陰性對照（Nc）無污染，片段大小約為230bp，證實為16srDNA V3區特異性片段。

3.4.2 DGGE條帶分析 不同馴化時期污泥樣品的DGGE條帶圖譜見圖5所示。污泥中微生物較高的菌種豐富度反映出系統良好的微生物多樣性。DGGE圖譜中不同樣品的條帶之間存在明顯的差異，這說明微生物的種群結構在不斷地發生著演替變化。

以樣品1為標準，用Quantity One軟件對DGGE凝膠各泳道的條帶進行比較（見圖6）。

圖5 培養馴化過程中污泥樣品的DGGE譜圖Fig.5 DGGE profile of sludge during the enrichment and cultivation

圖6 不同泳道DGGE條帶對比圖譜Fig.6 Comparative profile of DGGE in different lanes

泳道中條帶的粗細程度與樣品條帶在DGGE凝膠上的密度大小相對應。條帶粗、黑表明細菌密度大，條帶細、淡則表明細菌密度小。雖然在整個馴化過程中微生物種群結構發生了較大的改變，但是條帶5、8、14、16、17、18、20保持了一定的穩定性，說明它們所代表的細菌一直存在于整個系統的運行期間，具有較強的適應性。條帶1對應的微生物種群在泳道4（第45天）中才發現，而在此泳道中未發現條帶2、6、9、10、11、15、19所對應的的微生物種群。條帶3、7、13對應的微生物種群只出現在泳道2（第8天）、3（第24天）。同樣在泳道2中未發現條帶12所對應的微生物種群。這說明了在整個馴化過程中，微生物群落的結構和數量都發生了復雜的變化。

3.4.3 微生物種群結構相似性分析 采用戴斯系數（Dice coefficient）計算出各樣品的相似性（見表3），從而對各樣品之間的相似性進行比較。樣品2（第8天）與接種污泥相似性較低，為67.4%，樣品3（第24天）與接種污泥的相似性上升為69.5%，達到最高，隨后相似性降低。樣品4（第45天）與接種污泥的相似性達到最低，僅為35.0%。樣品2和樣品3相似性最高，可達83.6%。樣品2和樣品4的相似性僅為42.9%。這說明反應體系內微生物群落發生了復雜的變化，微生物系統存在較高的多樣性。

表3 DGGE圖譜相似性矩陣Table 3 Dice coefficients（Cs）comparing the similarities of DGGE fingerprints

4 結論

（1）在45天的氫自養厭氧馴化過程中，厭氧接種污泥能在短暫的適應期后表現出較高的高氯酸鹽降解活性，并且隨著馴化過程的進行降解速度顯著提高，最終實現對高氯酸鹽的高效去除，適宜作為后續反應器的接種污泥。

（2）馴化各周期的高氯酸鹽還原降解過程中都出現了pH的上升，且馴化周期時間越長，pH上升幅度越大。但實驗中及時更換培養基使馴化過程中pH變化基本始終在中性范圍內，因此沒有造成對微生物還原高氯酸鹽過程的抑制現象。

（3）馴化過程中，污泥蛋白含量相對馴化初期有一定程度的下降，但未影響高氯酸鹽去除效果，表明馴化富集產生的還原菌具有較高的高氯酸鹽還原活性。

（4）采用PCR－DGGE技術對接種厭氧污泥的反應體系內不同馴化時期的污泥進行微生物群落結構分析和對比，結果說明體系內具有良好的微生物多樣性，馴化過程中微生物群落結構發生動態變化，逐漸形成具有高氯酸鹽還原性能的微生物群落。

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