種豬精子密度快速簡(jiǎn)易評(píng)定技術(shù)的建立與驗(yàn)證

文│甄志剛（遼寧省錦州市畜牧技術(shù)推廣站）

李新國(guó)（中牧實(shí)業(yè)股份有限公司）

王宏軍 周鐵忠（遼寧醫(yī)學(xué)院）

隨著我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，人工授精技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，該項(xiàng)技術(shù)的成功應(yīng)用是加快豬品種改良和提高經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵。豬精子密度的評(píng)定是人工授精技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接決定著人工授精后母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)。目前由于商業(yè)精子密度儀的價(jià)格昂貴和血球計(jì)數(shù)法測(cè)定過(guò)程的費(fèi)時(shí)費(fèi)力，生產(chǎn)中很多技術(shù)人員對(duì)豬精子密度的評(píng)定不得不采用估測(cè)法，這種做法極大影響了母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)以及優(yōu)秀種公豬的利用效率。因此，研究開發(fā)精子密度的快速簡(jiǎn)易評(píng)定技術(shù)是養(yǎng)豬生產(chǎn)中亟待解決的問(wèn)題。不同品種豬的精液特性有差異，目前我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)中，大多數(shù)是利用杜洛克、長(zhǎng)白和大白這三種外種豬，因此，建立用于杜洛克、長(zhǎng)白和大白種公豬精子密度的快速簡(jiǎn)易評(píng)定技術(shù)具有重要意義。本試驗(yàn)以杜洛克、長(zhǎng)白和大白種公豬的精液為研究對(duì)象，利用精子密度與精液的吸光度之間的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，建立了利用721分光光度計(jì)評(píng)定精子密度的技術(shù)，并對(duì)其準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料。在遼寧省錦州市余積秋平人工授精站、廣地種豬場(chǎng)和黑山縣楊翔種豬場(chǎng)，選擇杜洛克、長(zhǎng)白、大白三個(gè)品種，實(shí)驗(yàn)人員用徒手采精法收集公豬精液。精液經(jīng)4層濾紙過(guò)濾，確保精液不含尿液等雜質(zhì)，收集得到的精液在30分鐘內(nèi)開始試驗(yàn)。試驗(yàn)主要使用的儀器和試劑有顯微鏡、721分光光度計(jì)、采精杯、電子天平、過(guò)濾紙、載玻片、蓋玻片、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、溫度計(jì)、生理鹽水等。

2.試驗(yàn)方法。

（1）豬精子密度快速簡(jiǎn)易評(píng)定技術(shù)的建立。選擇上述三個(gè)品種的種豬，每個(gè)品種采集30頭豬的精液。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，以生理鹽水為稀釋液， 將新鮮精液稀釋10倍，利用721分光光度計(jì)在550納米波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A），以生理鹽水做空白，用標(biāo)準(zhǔn)血球計(jì)數(shù)法測(cè)定稀釋前精子密度，每份精液樣品均重復(fù)測(cè)定3次，取平均值（誤差要求在5%以下）。

◎圖1 稀釋10倍后吸光度與精子密度的冪函數(shù)關(guān)系

◎圖2 稀釋10倍后吸光度與精子密度的線性函數(shù)關(guān)系

表1 721分光光度計(jì)法測(cè)定豬精子密度的對(duì)照表 億/毫升

（2）豬精子密度快速簡(jiǎn)易評(píng)定技術(shù)的驗(yàn)證。選擇上述三個(gè)品種的種豬，每個(gè)品種采集30頭豬的精液。以生理鹽水為稀釋液，分別利用建立的721分光光度計(jì)法和血球計(jì)數(shù)法測(cè)定豬精子的密度，每份精液樣品均重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

3. 數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL及統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行分析處理，并對(duì)吸光度和血球計(jì)數(shù)法法測(cè)定的精子密度進(jìn)行回歸方程擬合，對(duì)分光光度計(jì)計(jì)法和血球計(jì)數(shù)法測(cè)定的精子密度進(jìn)行相關(guān)分析和顯著性檢驗(yàn)。

二、結(jié)果與分析

1.豬精子密度快速簡(jiǎn)易評(píng)定技術(shù)的建立。研究結(jié)果表明，精子密度與精液吸光度顯著相關(guān)，兩者有多種函數(shù)關(guān)系，其中乘冪函數(shù)是吸光度與精子密度相關(guān)最緊密的，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.95（R2＝0.9），顯著高于線性函數(shù)，具體結(jié)果見圖1和圖2。根據(jù)獲得的回歸方程（y＝3.3917x1.2499），制訂了利用721分光光度計(jì)測(cè)定豬精子密度的對(duì)照表（見表1），并結(jié)合試驗(yàn)操作便利以及試驗(yàn)結(jié)果影響因素等方面，制定721分光光度計(jì)測(cè)定豬精子密度操作指南。

2.豬精子密度快速簡(jiǎn)易評(píng)定技術(shù)的驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果表明，利用721分光度計(jì)和精子密度儀測(cè)定結(jié)果均與血球計(jì)數(shù)法測(cè)定結(jié)果顯著相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.9以上，這提示利用721分光度計(jì)法測(cè)定豬精子密度具有可行性，能夠真實(shí)的反應(yīng)豬精子密度，可以在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

三、討論

豬精子密度評(píng)定是人工授精的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，采精后必須評(píng)定精子密度和活力，然后根據(jù)活力、密度和輸精有效精子數(shù)計(jì)算出稀釋倍數(shù)，這是保證受胎率和產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)鍵。然而，目前在豬生產(chǎn)上，由于專用精子密度儀價(jià)格過(guò)高，很多養(yǎng)殖戶無(wú)法擁有密度儀，只能采用估測(cè)法評(píng)定精子密度，該法主觀性強(qiáng)、準(zhǔn)確度差，導(dǎo)致人工授精效果不理想。本試驗(yàn)建立了用于杜洛克、長(zhǎng)白和大白種公豬精子密度的簡(jiǎn)易快速評(píng)定方法，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)證明，該法與血球計(jì)數(shù)法獲得的結(jié)果顯著相關(guān)，可以應(yīng)用于生產(chǎn)。

為保證分光光度計(jì)法評(píng)定精子密度的準(zhǔn)確性，針對(duì)分光光度計(jì)的型號(hào)、選擇合適的波長(zhǎng)和稀釋倍數(shù)至關(guān)重要。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，杜洛克、長(zhǎng)白和大白種公豬精液稀釋6、8、10倍后，吸光度均在721分光光度計(jì)的檢測(cè)范圍內(nèi)，為實(shí)踐中操作方便，我們選擇了10倍稀釋。關(guān)于測(cè)定精子密度合適的波長(zhǎng)，已有研究表明445～580納米范圍內(nèi)均可測(cè)定，我們選用550納米的測(cè)定結(jié)果表明重復(fù)性好、測(cè)定準(zhǔn)確。不同種類動(dòng)物精液吸光度與精子密度的函數(shù)關(guān)系不一樣，有的是直線回歸關(guān)系，有的是乘冪函數(shù)關(guān)系。以往報(bào)道中，有人利用直線回歸函數(shù)建立了分光光度計(jì)法評(píng)定豬精子密度，也有人利用冪函數(shù)建立分光光度計(jì)法，而比較本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明豬精子密度與精液吸光度之間最佳關(guān)系是乘冪函數(shù)關(guān)系。

本研究建立的豬精子密度評(píng)定技術(shù)是根據(jù)光的通透性與精子密度的密切相關(guān)這一特性開發(fā)的，因此，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性受精液成分影響較大，測(cè)定時(shí)要注意精子密度以外的其他干擾因素。稀釋好的稀釋液應(yīng)立即測(cè)定，否則因?yàn)橹亓ψ饔镁映恋讜?huì)造成結(jié)果不準(zhǔn)確。比色皿應(yīng)清洗干凈，透光面無(wú)雜質(zhì)和劃痕，操作時(shí)不能用手接觸透光面，以免影響吸光度測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。