二苯乙烯苷對C57BL/6J小鼠毛發生長影響的研究

張 焱，余 勇，吳立成

(1．金華職業技術學院醫學院，浙江 金華 321017；2．金華市食品藥品檢驗所，浙江 金華 321000)

·基礎與臨床研究·

二苯乙烯苷對C57BL/6J小鼠毛發生長影響的研究

張 焱1，余 勇1，吳立成2

(1．金華職業技術學院醫學院，浙江 金華 321017；2．金華市食品藥品檢驗所，浙江 金華 321000)

目的：探討二苯乙烯苷對小鼠毛囊毛發生長周期及其小鼠觸須毛囊體外培養的影響。方法將C57BL/6J小鼠分組，采用不同濃度的二苯乙烯苷灌胃以及培養液離體培養小鼠觸須毛囊的方法，在給藥后的不同時間觀察各組小鼠毛發生長狀況。結果二苯乙烯苷灌胃組中，50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組較對照組明顯誘導C57BL/6J小鼠毛發生長，縮短小鼠皮膚變黑時間，早期加速小鼠毛發的生長速度，差異有統計學意義(P<0.05)，且100μg/ml組作用更明顯(P<0.01)。二苯乙烯苷離體培養小鼠觸須毛囊組中， 0.1mg/L、0.3mg/L組培養第8天毛囊毛發生長長度大于對照組和其他實驗組。結論二苯乙烯苷具有明顯的促進毛發生長作用。

C57BL/6J小鼠；毛發生長周期；二苯乙烯苷；毛囊體外培養

Abstract:[Objective] To discuss the effect of stilbene to growth cycle of hair and palp’s hair follicle culture in vitro in C57BL/6J mouse.[Method] Stilbene was used in C57BL/6J mouse in different concentration .The mouse were divided into two groups .Group one was practiced with administration by gavage . Group two was used culture solution to culture palp’s hair follicle. The two group’s hair growth situation were observed.[Result] In group one, 50mg/ml,100mg/ml and 150mg/ml stilbene can induce hair growth and shorten skin blacken time obviously . The difference is significant (P<0.05). Among the group, 100ug/ml stilbene’s effect was most obvious (P<0.01). In group two, 0.1mg/L,0.3mg/L stilbene can make hair follicle grow longer than comparison group after 8 day’s culture. [Conclusion] Stilbene can accelerate the growth of hair obviously.

Keywords: C57BL/6J mouse; growth cycle of hair; stilbene; hair follicle culture in vitro

脫發是臨床常見疾病,脂溢性脫發、斑禿等脫發問題一直是臨床治療的難題。何首烏是臨床上治療斑禿的主要中藥之一。現代藥理學研究已表明，何首烏的主要活性成分二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-0-Beta-D-glucoside，THSG)具有抗衰老、降低膽固醇、提高免疫功能、防止動脈硬化及保護細胞等功效[1-2]，但是否對毛發具有生長作用以及通過何種途徑發揮作用，國內外文獻尚未見報道。我們以動物實驗為基礎，于2011年至2012年與金華市食品藥品檢驗所合作研究探討二苯乙烯苷對小鼠毛囊毛發生長及其小鼠觸須毛囊體外培養的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～8周齡的近交系C57BL/6J小鼠由金華市食品藥品檢驗所提供，SPF級，雌性，體質量20～26g，選擇鼠皮為粉紅色、毛發處于休止期的小鼠。

1.1.2 二苯乙烯苷 參考戚愛棣[3]研究報道方法進行提取。

1.2 方法

1.2.1 小鼠體內灌服實驗

1.2.1.1 實驗分組：分為7組，每組6只小鼠。將松香與石蠟混合加熱融化涂于小鼠背部，涂抹面積約3cm×4cm，冷卻凝固后揭去，以去除背毛。確認休止期(小鼠背部皮膚呈粉紅色)開始給藥。

1.2.1.2 給藥：對照組為陰性組，不灌服二苯乙烯苷；實驗組分別把濃度為1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml的二苯乙烯苷1ml灌入C57BL/6J小鼠體內，觀察小鼠皮膚顏色變化和毛發生長情況。

1.2.1.3 觀察記錄：灌服后每天觀察小鼠皮膚及毛色變化，記錄每只小鼠背部去毛區的皮膚顏色從服藥到開始變黑的時間(陰性對照組則記錄小鼠皮膚從粉紅色到開始變黑的時間)；從開始變黑到長滿毛的時間以及開始變黑至開始變灰的時間。給藥后第9天、18天，每組隨機選擇3只小鼠，處死, 取相同脫毛區皮膚,做常規石蠟切片和蘇木素伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下進行組織形態學觀察,并與對照組進行比較。繼續觀察余下小鼠皮膚顏色變化和毛發生長情況。

1.2.2 小鼠觸須毛囊體外實驗

1.2.2.1 小鼠觸須毛囊器官培養的建立：6～8周齡的C57BL/6J小鼠(由金華市食品藥品檢驗所提供)，斷頸處死，立即剪去雙側胡須，用75%乙醇消毒上唇部3遍，無菌條件下剪取雙側胡須墊，置于D-Hanks液中，反復沖洗3遍后置于Williams培養液中，在立體解剖顯微鏡下用顯微剪、鑷分離出生長期毛囊，選取完整無損傷的生長早期毛囊減去上1/3部分。毛囊培養在96孔板(Costar公司)中進行，每孔僅放一個毛囊，每孔含Williams無血清培養液0.2ml，然后放進37℃、5%CO2的孵箱中培養。

1.2.2.2 實驗分組：分為9組，每組8個毛囊，對照組Williams培養液中不加二苯乙烯苷。實驗組分8組，在Williams培養液中加入二苯乙烯苷，使二苯乙烯苷的濃度分別為0.001mg/L、0.003mg/L、0.01mg/L、0.03mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、1mg/L、3mg/L。

1.2.2.3 觀察記錄毛發生長情況：培養的第1天至第8天，經倒置顯微鏡下通過目鏡測微器每天測量自毛囊底部至毛發頂部的長度，將第8天與第1天的測量結果相減即為毛發生長長度，比較各組的毛發生長長度。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 皮膚顏色改變

與對照組比較，二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組明顯縮短了小鼠皮膚變黑時間，皮膚由黑色到長滿毛的時間間隔也明顯縮短，且100μg/ml組作用更明顯(P<0．01)。對小鼠皮膚變灰時間, 各組間無顯著差異。結果見表1。

表1 二苯乙烯苷灌胃對鼠毛發生長周期的影響

與對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

2.2 毛囊及毛細血管增長

給藥第9天,二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組較對照組小鼠脫毛區毛囊較大, 數量較多，多數分布在真皮深層，而且真皮層小血管數量明顯增多(圖2A、2B)。給藥第18天, 對照組小鼠脫毛區毛囊數量較少且縮短、扭曲, 真皮層小血管數量也較少(圖2C)。二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組小鼠脫毛區毛囊數量增多明顯, 且毛囊、毛乳頭較大、生長旺盛，真皮層小血管數量也明顯增多(圖2D)。結果見表2。

表2 二苯乙烯苷灌胃對鼠脫毛區皮膚毛囊數和小血管數的影響

與對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

A 第9天對照組毛囊較小，位于真皮和皮下組織交界，血管少

2.3 毛發生長長度

培養第8天各組小鼠毛囊毛發平均生長長度見表3。二苯乙烯苷0.1mg/L、0.3mg/L組的毛發生長長度大于對照組，其余各組和對照組之間的毛囊毛發生長長度差異無統計學意義。

表3 二苯乙烯苷小鼠觸須毛囊生長的影響

與對照組比較:*P<0.05 ，**P<0.01

3 討論

本實驗選擇6～8 周的C57BL/6J小鼠，其所有毛囊已由生長期進入靜止期, 生理狀態下不再自發進入生長期，需經人工脫毛或者拔毛等刺激后，誘導其毛發進入生長期, 并可自發經過退行期再進入休止期。此周期活動與自然周期相比無明顯差異[4]。小鼠軀干皮膚黑色素細胞只存在于毛囊中，且僅在生長期時合成黑色素并傳遞給角質形成細胞使皮膚變為黑色。至退行期，黑色素生成減少，皮膚變成灰色，休止期皮膚再變為粉紅色。因此，可以根據小鼠皮膚顏色來大致判斷其毛發生長周期情況[5]。

我們采用二苯乙烯苷作為實驗藥物，采用灌胃給藥和小鼠觸須毛囊體外培養的方法，研究二苯乙烯苷對C57BL/6J小鼠毛囊毛發生長周期的影響。肉眼觀察結果發現，二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組較對照組小鼠的背部皮膚顏色由粉紅色轉變為黑色的時間縮短，顯示提前由休止期進入生長期(P<0.05)，差異有統計學意義。進人生長期后這幾組小鼠的毛發生長速度也明顯快于對照組(P<0.05)，差異有統計學意義，且100μg/ml組作用更明顯(P<0.01)。組織學檢查結果與肉眼觀察的皮膚顏色變化一致，二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml組和150μg/ml組能明顯增加皮膚毛囊數及毛囊毛細血管數量，從而營養毛囊, 使毛囊變多、變粗，達到加快毛發生長的作用。其余劑量組則與對照組相比無差異。小鼠觸須毛囊體外實驗結果顯示二苯乙烯苷0.1mg/L、0.3mg/L組的毛發生長長度大于對照組(P<0.05)，差異有統計學意義。研究結果表明，適量的二苯乙烯苷無論灌胃還是體外培養均能誘導C57BL/6J小鼠毛發生長，促進C57BL/6J小鼠毛發由休止期向生長期轉變，明顯縮短小鼠皮膚變黑時間，能加速小鼠毛發在生長期早期的生長，但對毛發生長周期無明顯影響。其作為生發藥物作用機制還有待于進一步研究。

[1]張彩平,楊瀅,田英,等. 二苯乙烯苷對 H2 02 誘導血管內皮細胞黏附分子表達的影響[J]. 中國藥理學通報,2012,28 (8):1088-1092.

[2]李彩蓉,蔡飛,黎榮,等.二苯乙烯苷對高糖誘導系膜細胞衰老相關信號的調節作用[J].中國藥理學通報,2010,26 (2):272-273.

[3]戚愛棣. 何首烏中二苯乙烯苷提取工藝優選及炮制對其含量的影響[J].中草藥,2002,33 (7):609.

[4]Paus R, Handjiski B, Czarnetzki BM, et al. A murine model for inducing and manipulating hair follicle regression ( catagen) : effects of dexamethasone and cyclosporin A [J]. J Invest Dermatol , 1994, 103(2) : 143-147.

[5]Slominski A, Paus R. Melanogenesis is coupled to murine anagen: toward new concepts for the role of melanocytes and the regulation of melanogenesis in hair growth [J]. J Invest Dermatol, 1993, 101( 1 Suppl ) : 90S-97S.

TheeffectofstilbenetogrowthcycleofhairinC57BL/6Jmouse

ZHANGYan1,YUYong1，WULicheng2

(1．Jinhua Polytechnic Medical College，Zhejiang 321017 ，China；2．Jinhua City Food and Drug Inspection Institute,Zhejiang 321000,China)

R758.71

A

1672-0024(2013)02-0038-04

金華市科技計劃項目(編號：2007-3-060)