一種基于銅配合物的高靈敏硫化氫熒光探針

黃 彬 陳韻聰 郭子建 何衛江

(南京大學化學化工學院配位化學國家重點實驗室，南京 210093)

0 引 言

硫化氫是繼NO與CO之后的第三個被確認的人體氣體信號分子，在神經信號傳導過程中起著十分重要的調節作用[1-4]。同時硫化氫還被發現在心血管系統中也具有許多重要的生理功能，如調節血管平滑肌的舒張、抗氧化、抑制發炎、降低新陳代謝速率等[5-9]。硫化氫水平異常還被認為與阿爾茲海默氏癥、唐氏綜合癥、糖尿病和肝硬化等密切相關[10-13]。硫化氫的生理學和病理學功能研究已經成為目前化學與生物學研究的熱點，而發展準確快捷的硫化氫檢測方法成為該領域的關鍵課題之一。傳統H2S檢測技術包括比色法、電化學法和氣相色譜法等[14-19]。這些方法不僅需要進行樣品預處理，而且無法進行細胞和活體中硫化氫的實時原位檢測，也不能提供空間分布信息。這也正是目前體內各組織的硫化氫濃度水平存在較大爭議的主要原因[20-22]。

由于靈敏度高、響應快和可實現生物實時造影等特點，熒光分析和造影已成為生物分子實時跟蹤的重要手段和研究熱點。近年來硫化氫熒光探針的研究逐漸引起人們的關注,已有多例硫化氫熒光探針的研究報道[23-32]。這些熒光探針有的已可用于血液中H2S的檢測或者細胞中的成像，對內源性硫化氫檢測研究有極大的促進作用。由于硫化氫的pKa1約為 7.04，在生理(pH 7.40)條件下硫化氫會發生脫質子解離作用，胞內H2S與HS-的比例約為1∶2(nH2S∶)。因此文獻中常以NaHS或Na2S作為H2S供體進行探針響應性能的研究。

硫化氫熒光探針主要有3種設計策略：1.利用硫化氫的還原性將探針的疊氮基團還原為氨基從而改變探針分子的熒光性質[23-24]；2.利用硫化氫的親核性通過對探針分子的親核進攻改變探針分子的熒光性質[25-27]；3.利用 S2-與 Cu2+極強的親和力(溶度積常數KSP=6×10-36)將Cu2+從與熒光配體形成的銅配合物中脫除。由于具有順磁效應的Cu2+具有猝滅熒光的特點，相應銅配合物的熒光很弱。Cu2+的脫除可以使得熒光配體的熒光得到恢復，表現出對硫化氫的熒光增強響應[28-30]。目前大部分報道的硫化氫熒光探針采用前兩種設計策略。這兩種設計策略中使用的化學反應大多不可逆，探針基本不能重復利用，而且多數反應需要較長的時間完成(10～120 min)，難以實現硫化氫的快速跟蹤和實時檢測。第三種設計策略有其獨特的優勢，脫除反應不僅響應迅速有利于實現硫化氫的快速跟蹤，而且釋放出的熒光配體可與Cu2+重新結合形成配合物探針實現再利用。同時由于CuS的溶度積非常小，該類探針對S2-往往具有很高的靈敏度。本研究基于第三種策略設計了一個新的基于銅配合物的H2S熒光探針，其中的熒光配體1通過將4-氨基-7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑 (NBD)熒光團的4-氨基修飾為水溶性的銅離子螯合團三乙烯四胺而獲得。采用NBD熒光團則是因為其可見光激發性能有利于降低生物樣本檢測中的光毒性和自發熒光干擾。同時其較大的斯托克斯位移、良好的水溶性和生物相容性也有利于探針的實際應用。熒光配體1的合成路線如圖1所示。

圖1 熒光配體1的合成路線Fig.1 Synthesis of fluorescent ligand 1

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

合成中所用主要試劑為南京大學化學化工學院采購的國產試劑。Boc-ON和NBD-Cl購自Aldrich，三乙烯四胺為化工廠工業品。光譜測試中的溶劑為Aldrich光譜純溶劑，配制溶液用水為二次水，HEPES和各類無機鹽也來自Aldrich。電噴霧質譜由LCQ電噴霧質譜儀(ESI-MS，Thermo Finnigan)測定，同位素分布峰分析采用ISOPRO程序模擬。核磁共振譜分別在Bruker DRX-500和Bruker DRX-300核磁共振波譜儀上采集。吸收光譜用Shimadzu UV-3100分光光度計測定。熒光光譜由AMINCO Bowman series 2熒光光譜儀記錄。pH值用PHS-3精密pH計記錄。

1.2 熒光配體1的合成

100 mL三頸瓶中加入三乙烯四胺(720 mg，4.92 mmol)和25 mL THF，冰浴下攪拌滴加30 mL含Boc-ON(2.47 g,10.03 mmol)的THF溶液。1 h內滴加完畢后室溫繼續攪拌18 h。脫去溶劑后進行柱層析分離得淡黃色固體 2(二氯甲烷/甲醇，4∶1，V/V)，產量：1.18 g，產率：69.4%。

100 mL圓底燒瓶中分別加入化合物2(0.346 g,1.0 mmol)、NBD-Cl(0.199 g,1.0 mmol)、無水碳酸鉀和15 mL乙腈，室溫攪拌4 h后抽濾。濾液脫去溶劑后獲得的殘余物經柱層析(二氯甲烷/乙酸乙酯，4∶1，V/V)后得化合物 3，產量：240 mg，產率：47.2%。

25 mL圓底燒瓶中分別加入化合物3(0.204 g，0.4 mmol)、2 mL二氯甲烷和1 mL三氟乙酸。室溫攪拌2 h后脫去溶劑即得熒光配體1，產量:112 mg，產率：91.2%。1H NMR(500 MHz,D2O，ppm)δ:8.37(d,J=8.5 Hz,1H),6.29 (d,J=8.5 Hz,1H),3.67(br,2H),3.08 (t,J=6.3 Hz,4H),2.96 (t,J=6.2 Hz,2H),2.89 (t,J=6.3 Hz,4H).13C NMR (125 MHz,D2O)δ:145.96,143.91,143.60,138.58,119.99,100.58,50.36,40.81,37.06.MS-ESI (positive mode,m/z):Calcd.310.15,Found 310.25 for[M+H]+.

1.3 熒光配體1的光譜測試

取化合物1的DMSO儲備液加入到100 mL容量瓶中，以含5%DMSO(V/V)的HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)定 容配制成濃度分別為 100 μmol·L-1和 10.0 μmol·L-1的溶液。熒光配體1的吸收光譜利用前者測定，而其Cu2+滴定吸收光譜測定是通過向3 mL上述溶液(100 μmol·L-1)中分別加入不同體積的Cu2+水溶液(12 mmol·L-1，每次 2.5 μL)充分混勻后測定。 化合物 1的熒光光譜測定利用濃度為10.0 μmol·L-1的溶液測試完成，其Cu2+熒光滴定光譜則是通過向3 mL溶液中分別加入不同體積的Cu2+水溶液(1.2 mmol·L-1，每次加2.5 μL)后進行測定的。

1.4 熒光配體1對不同金屬離子的熒光響應測試

化合物1對金屬離子的熒光選擇性響應實驗在含 5%DMSO(V/V)的 HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)中進行。 在向3 mL 化合物 1 溶液(10.0 μmol·L-1)中加入 2.5 μL 金屬離子水溶液充分混勻后進行熒光光譜測定。測定堿金屬或堿土金屬離子響應時溶液中被測金屬總濃度為化合物1濃度的1 000倍。測定其他金屬離子響應時被測金屬離子的總濃度與化合物1濃度相等。

1.5 配合物1-Cu2+的S2-熒光滴定

實驗同樣在前述含5%DMSO的HEPES緩沖溶液中進行。配合物探針1-Cu2+通過加入等當量的熒光配體1和Cu2+形成。滴定通過逐漸向3 mL 1-Cu2+配合物溶液(10.0 μmol·L-1)中加入不同體積的Na2S水溶液(1.2 mmol·L-1，每次加 2.5 μL)進行，光譜測定均在充分混勻后完成。

1.6 配合物1-Cu2+的陰離子熒光選擇性響應測試

配合物探針1-Cu2+對陰離子的選擇性響應能力及S2-與其他陰離子的競爭響應實驗也在前述的HEPES緩沖溶液中進行。選擇性實驗中向3 mL配合物 1-Cu2+(10.0 μmol·L-1)溶液中分別加入 12.5 μL濃度為 12 mmol·L-1硫化鈉水溶液(5 equiv)或12.5 μL濃度為480 mmol·L-1的其他陰離子 (100 equiv)溶液，充分混勻后分別進行熒光光譜測定。競爭實驗中則在加入12.5 μL濃度為480 mmol·L-1的競爭陰離子溶液后繼續加入12.5 μL濃度為12 mmol·L-1硫化鈉水溶液，充分混合后進行測定。

1.7 探針1-Cu2+的線性響應范圍及檢測限測定

測試在含 10 μmol·L-11-Cu2+配合物的前述緩沖溶液中進行。向3 mL探針溶液中分別加入不同體積的 Na2S 水溶液(1.2 mmol·L-1)，每次加 2.5 μL，充分混勻后進行熒光測試。檢測限測試先掃描背景20遍，獲得標準偏差σ，再根據線性范圍內的斜率(S)利用3σ/S求出檢測限。

2 結果與討論

2.1 熒光配體1的Cu2+紫外滴定研究

自由熒光配體1的最大吸收峰出現在478 nm，相對摩爾吸光系數為 1.7×104L·mol-1·cm-1(圖 2)。 隨著Cu2+的加入，該吸收峰逐漸降低并發生藍移，同時在400 nm處的吸收逐漸增強。滴定光譜在455、350及310 nm處有3個清晰的等吸收點，表明化合物1與Cu2+發生了配位作用形成了穩定的配合物。從根據478和400 nm處的吸收強度繪制的滴定曲線可以看出熒光配體1的吸收隨著加入Cu2+總濃度發生線性變化。在加入1倍的Cu2+后繼續滴加Cu2+吸收光譜趨于穩定。這些結果表明化合物1與Cu2+是以1∶1方式配位結合的。根據NBD類熒光分子的相關報道可推測478 nm處的吸收峰為NBD的分子內電荷轉移(ICT)吸收峰[33-34]，而當4-氨基參與配位后ICT效應減弱并導致吸收峰發生藍移。

圖2 熒光配體 1(100 μmol·L-1)在含 5%DMSO(V/V)的HEPES 緩沖溶液(50mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)中的Cu2+紫外滴定光譜圖Fig.2 Absorption spectra of compound 1(100 μmol·L-1)obtained upon Cu2+titration in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO(V/V)

2.2 熒光配體1的Cu2+熒光滴定研究

圖3 熒光配體 1(10 μmol·L-1)在含 5%DMSO(V/V)的HEPES 緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH7.20)中的 Cu2+熒光滴定光譜圖Fig.3 Emission spectra of compound 1(10 μmol·L-1)obtained in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO(V/V)upon Cu2+titration

熒光光譜測定發現自由熒光配體1的最大激發波長為470 nm，最大熒光發射波長為548 nm，斯托克斯位移將近80 nm，有利于降低熒光檢測中激發的干擾，達到設計目的。從Cu2+熒光滴定結果可以看出(圖3)，化合物1的熒光強度隨著Cu2+濃度的增加線性降低，而發射波長并沒有移動。當加入Cu2+的量達到1當量后繼續滴加則熒光光譜變化很小，也再次證實了化合物1與Cu2+的1∶1配位方式。Cu2+滴定導致的熒光顯著降低的原因是順磁性Cu2+配位后引起化合物1的熒光發生顯著猝滅，這也是順磁性金屬離子的一個重要特性。Cu2+這種對配體熒光的顯著猝滅作用為發展基于銅配合物Cu2+脫除的S2-增強響應奠定了基礎。

2.3 熒光配體1對不同金屬離子的熒光響應

熒光配體1(10 μmol·L-1)對不同金屬離子的熒光響應行為同樣在前述HEPES緩沖中測定 (圖4)。實驗結果顯示只有Cu2+造成顯著的熒光猝滅，等當量Cu2+可導致近90%的熒光猝滅。其他金屬離子對化合物1的熒光影響不大，Hg2+雖然也造成一定的熒光猝滅，但猝滅效應明顯小于Cu2+。由于Cu2+配位導致該熒光配體的熒光猝滅效應最強，相應配合物在金屬離子脫除過程中顯示的熒光增強效應將會更加顯著，因此化合物1的銅配合物更具有作為熒光增強型硫化氫探針的潛力。

圖4 不同金屬離子對含5%DMSO(V/V)的HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH7.20)中熒光配體 1(10 μmol·L-1)在 548 nm處熒光的猝滅效應(λex=470 nm)Fig.4 Emission decreasing factor at 548 nm of compound 1(10 μmol·L-1)induced by different metal cations in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO(V/V)(λex=470 nm)

2.4 配合物1-Cu2+對硫化氫熒光響應研究

圖5 含 5%DMSO(V/V)的 HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)中配合物 1-Cu2+(10 μmol·L-1)對硫化氫的熒光響應Fig.5 Emission spectra of complex 1-Cu2+(10 μmol·L-1)obtained upon S2-titration in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO

配合物1-Cu2+對硫化氫熒光響應研究同樣在前述含5%DMSO的HEPES緩沖溶液中完成(圖5)，實驗中采用Na2S作為硫化氫供體，配合物通過加入等當量的熒光配體和銅離子現場形成。實驗結果顯示隨著加入S2-濃度的增加體系的熒光強度明顯增強，熒光增強可達8倍以上。這表明S2-確實能將配合物體系中的Cu2+奪去并逐步恢復熒光配體1的熒光，實現對S2-的增強響應。同時滴定實驗發現熒光增強響應幾乎在硫化鈉滴加的瞬間完成，表明這一探針對硫化氫的響應速度非常快，可以滿足硫化氫動態跟蹤的需要，也完全符合前述配合物脫除銅離子的響應機制。從相應的熒光響應照片(圖6)可以看出在紫外光照射下1-Cu2+配合物溶液幾乎沒有熒光，而當5當量的Na2S加入之后溶液瞬間發出黃色熒光，而且與化合物1在紫外燈照射下發出的熒光一致，顯示化合物1的熒光在硫化鈉加入后得到恢復。這一現象也表明配合物1-Cu2+對硫化氫的熒光識別非常靈敏可靠，可以通過肉眼觀察來實現。由熒光滴定曲線可以看出配合物1-Cu2+對硫化氫的線性響應范圍為 1～20 μmol·L-1。 根據 1.7 所述實驗和計算方法確定配合物探針對硫化氫的檢測低限為0.2 μmol·L-1，而文獻中目前報道的絕大多數探針檢測限在1 μmol·L-1以上[32]，這也表明配合物 1-Cu2+體系具有較高的靈敏度。將熒光得到恢復的溶液再加入Cu2+，熒光再度發生類似于圖3中出現的猝滅現象，說明本體系可以用于重復檢測H2S。

圖6 紫外燈照射下配合物1-Cu2+(10 μmol·L-1)在含5%DMSO(V/V)的 HEPES 緩沖溶液(50 mmol·L-1 HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)中對 Na2S的熒光響應照片Fig.6 Photograph of complex 1-Cu2+(10 μmol·L-1)in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO under the irradiation with UV lamp of 365 nm

圖7 10 μmol·L-1配合物 1-Cu2+在含 5%DMSO(V/V)的 HEPES 緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)中對不同陰離子的熒光響應(a)及由不同陰離子引發的548 nm處熒光增強比例柱狀圖(b)Fig.7 (a)Emission spectra of 10 μmol·L-1complex 1-Cu2+obtained in the presence of 5 equiv S2-or 100 equiv other anions in HEPES buffer(50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.20)containing 5%DMSO.(b)Histogram of F/F0at 548 nm of 1-Cu2+in the presence of different anions

2.5 配合物1-Cu2+對硫化氫熒光響應的選擇性

為明確配合物1-Cu2+對硫化氫熒光識別的選擇性，研究還在前述HEPES緩沖溶液中測定了其他陰離子存在下該配合物的熒光光譜。測定中探針濃度為 10 μmol·L-1，S2-濃度為 50 μmol·L-1，其他陰離子濃度為 1 000 μmol·L-1。實驗結果顯示(圖 7)，配合物1-Cu2+溶液加入 100倍其他陰離子如 Ac-、SO42-、HSO42-、F-、Cl-、Br-、I-、HCO32-、CO32-、HPO42-、 H2PO4-、NO2-、SCN-、HSO32-、SO32-、S2O32-、S2O42-時熒光強度變化很小。相反加入5當量的S2-可使探針體系的熒光顯著增強8倍以上。同時即使在高濃度的其他陰離子存在下，配合物1-Cu2+對硫化氫的增強響應也不受明顯影響。這些結果表明配合物探針1-Cu2+對硫化氫的增強響應具有很好的選擇性，大濃度其他常見陰離子的存在不會干擾對硫化氫的檢測。這也為該探針的生物檢測應用奠定了基礎。

3 結 論

本研究設計的基于NBD熒光團的熒光配體1能與Cu2+形成1∶1的配合物1-Cu2+，并使其熒光顯著猝滅。配合物1-Cu2+能選擇性地對硫化氫表現出8倍以上的熒光增強響應。熒光響應機理是S2-與Cu2+結合將Cu2+從配合物中有效脫除進而解除了Cu2+對熒光配體的熒光猝滅效應，導致配體熒光恢復增強。該體系具有響應迅速、可重復利用的特點，靈敏度也高于大部分目前報道的硫化氫探針。探針的可見光激發特點及良好的硫化氫響應性能使得該體系在檢測生物樣品中的硫化氫方面具有廣闊的應用前景。

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