聚酰胺胺樹形分子的葉酸修飾及其表征

吳江渝，董興梅，肖 夏

（武漢工程大學材料科學與工程學院，湖北 武漢 430074）

0 引 言

葉酸（Folic acid，FA）是一種常見的B族維生素，又稱蝶酰谷氨酸.葉酸是人體中不可或缺的一種維生素，葉酸缺乏會引起巨紅細胞貧血癥，嚴重時甚至會引起白細胞減少癥.此外，由于腫瘤細胞表面具有大量表達的葉酸受體，葉酸還具有抗腫瘤靶向的作用.樹形分子由于具有納米尺度、高水溶性、單分散性以及結構可調性，使其特別適合用作抗癌藥物和成像藥物的輸送載體［1－2］.相比于脂質體和兩性分子載體化合物，樹形分子支架中的共價鍵提供了更穩定的載體結構，使之能夠經受住生理條件的變化，并能保護藥物分子不被快速地分解，保證其發生特定的藥物釋放，促使藥物分子在腫瘤細胞中保持一定的藥效濃度［3］.研究發現基于樹形分子的藥物控制釋放體系相比于線性聚合物載體（例如PEG）具有更優越的藥物載體性能，這是由于樹形分子的納米尺寸和在溶液中緊密的球面結構所引起的［4］.

葉酸與癌細胞表面的葉酸受體的高度親和力使得葉酸成為了一種識別腫瘤細胞的靶向分子［5－6］.葉酸分子中含有兩個羧酸基團：α－羧基和γ－羧基.研究發現利用葉酸的γ－羧基接枝到樹形大分子上得到的樹形分子－葉酸化合物與細胞表面仍具有較高的親和力［7］.利用葉酸對腫瘤細胞的靶向作用和樹形分子可以作為藥物載體的特性，可向腫瘤組織靶向性輸送抗癌治療藥物以及放射顯影劑等.基于樹形分子葉酸靶向的藥物釋放體系相比于非靶向樹形分子和純抗癌藥物在癌細胞中表現出更高的藥物積累量和更好的治療效果［7］.

本文采用發散法合成以乙二胺為核的聚酰胺胺（Polyamidoamine，PAMAM）樹形分子.將葉酸通過兩個連續的反應步驟接枝到樹形分子表面，得到樹形分子－葉酸化合物，并對所得到的一系列樹形分子－葉酸化合物進行了紅外光譜以及紫外－可見光譜的表征.這種具有靶向性的樹形分子藥物載體材料對提高抗癌藥物的有效性提供了可能.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

葉酸、醋酸、醋酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、吡啶購自國藥集團上海化學試劑公司，N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N，N－二環己基碳酰亞胺（DCC）、乙二胺、丙烯酸甲酯購自國藥集團化學試劑有限公司，乙二胺和丙烯酸甲酯使用前重蒸.

PB－10pH計（Sartoriuos公司）、85－2型恒溫磁力攪拌器（上海市易友儀器有限公司）、RE－52型旋轉蒸發器（上海市嘉鵬科技有限公司）、TU－1900雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、Nicolet is10紅外光譜儀（美國Nicolet公司）.

1.2 實驗方案

在實驗的過程中，乙二胺為核的PAMAM樹形分子采用經典的發散合成法制得.樹形分子－葉酸化合物的實驗步驟如圖1所示.

圖1 PAMAM－FA合成路線圖Fig.1 Synthesis of PAMAM－FA

1.2.1 葉酸標準曲線實驗 量取冰醋酸5.7g加入1000mL容量瓶中，向其加入91g醋酸鈉，加入蒸餾水定容至刻度線.震蕩至其完全溶解.即配成了質量濃度為0.1mol／L且pH＝5.8的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液.以此緩沖液為溶劑配制質量濃度分別為0.001、0.0025、0.0050、0.0075、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030mg／mL的葉酸標準溶液，并測定其在吸收波長λ＝280nm處的吸光度.

1.2.2 PAMAM樹形分子的合成 PAMAM樹形分子的合成通過兩步反應得到：邁克爾加成反應和酰胺化反應.首先，以乙二胺為核與過量的丙烯酸甲酯反應，伯胺基與雙鍵加成得到末端為酯基的半代樹形分子.半代樹形分子與過量的乙二胺反應得到末端為伯胺基的整代樹形分子.如此交替重復反應得到高代樹形分子［8］.實驗得到0至4代的樹形分子（G0－PAMAM末端含4個氨基，G1－PAMAM末端含8個氨基，依此類推）.

1.2.3 葉酸活化酯的制備 稱取2.512g葉酸于100mL圓底燒瓶中，加入70mL DMSO攪拌使其完全溶解.向其中加入1.175g的DCC和715mg的NHS.25℃下劇烈攪拌反應5h，停止反應.將反應液過濾除去白色固體副產物DCU，得到葉酸活化酯溶液.

1.2.4 樹形分子－葉酸化合物的制備 分別稱取 G0－PAMAM 120mg、G1－PAMAM 130mg、G2－PAMAM 118mg、G3－PAMAM 80mg、G4－PAMAM 106mg溶于5mL DMSO中，攪拌狀態下分別向其逐滴加入葉酸活化酯溶液7、9、12、15、16mL.加入兩滴新蒸吡啶做催化劑.劇烈攪拌反應兩天.將0代和1代反應粗產物用乙醚沉降，得到鵝黃色絮狀沉淀，冷凍干燥即得到黃褐色固體粉末G0－PAMAM－FA、G1－PAMAM－FA.將2、3、4代反應粗產物用截留分子量3500的透析袋透析提純.冷凍干燥得到黃褐色固體粉末 G2－PAMAM－FA、G3－PAMAM－FA和G4－PAMAM－FA.

2 結果與討論

2.1 葉酸紫外吸收標準曲線的繪制

測定不同濃度葉酸標準溶液在吸收波長λ＝280nm處的吸光度，繪制出吸光度隨濃度變化的紫外吸收葉酸標準曲線，如圖2.

圖2 葉酸標準曲線Fig.2 Standard absorption curve of folic acid

2.2 催化劑的選擇

在葉酸的活化反應中，嘗試了兩種催化劑方案：一種是采用NHS／EDC作為催化劑，反應過程中副反應比較少，幾乎沒有副產物生成，但是反應后處理不易.另一種是采用NHS／DCC做催化劑.反應過程迅速，有少量白色不溶副產物DCU生成，但易分離.因此實驗中選擇NHS／DCC作為葉酸活化反應的催化劑.葉酸活化酯與樹形分子的反應是一種酰胺化反應，反應中常用的催化劑有吡啶和三乙胺.實驗發現吡啶在實驗進程中催化活性明顯高于三乙胺，故選擇吡啶作為反應的催化劑.

2.3 紅外表征（IR）

圖3為0代到4代樹形分子－葉酸化合物的紅外光譜圖.根據分析可以發現，在3300～3500 cm－1處為N－H的伸縮振動吸收峰.在3000～3100cm－1處為葉酸分子中苯環中C－H伸縮振動吸收峰.由于該峰較弱，它常被附近的強吸收峰所覆蓋.在波數為1600～1450cm－1之間的吸收峰是苯環骨架上C＝C的伸縮振動，說明存在明顯的苯環結構.1700cm－1附近的吸收峰為C＝O伸縮振動峰.在819cm－1和641cm－1出現葉酸中苯環和雜環－CH的面外彎曲振動吸收特征峰.通過判斷這些基團的存在，可以推知葉酸分子已經和PAMAM樹形分子反應，葉酸分子成功接枝到樹形分子上.

圖3 各代PAMAM－FA化合物的紅外光譜圖Fig.3 FT－IR spectra of PAMAM－FA compounds

2.4 紫外光譜表征

用pH值為5.8的醋酸－醋酸鈉緩沖液作為溶劑分別配制質量濃度為0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125mg／mL 的 G0－PAMAM－FA、 G1－PAMAM－FA、 G2－PAMAMFA、G3－PAMAM－FA、G4－PAMAM－FA 溶 液，并用紫外分光光度計測定其紫外吸收光譜.圖4至圖8為不同濃度的各代樹形分子－葉酸化合物的紫外吸收光譜圖.從圖中可以發現，樹形分子－葉酸化合物在285nm處的吸收值隨著該化合物的濃度的增加而增加.通過對照葉酸標準曲線可以計算出相應溶液中的葉酸濃度，從而進一步計算出各代樹形分子與葉酸的平均接枝率.計算可得平均每個G0－PAMAM樹形分子接枝約1.25個葉酸分子，G0－PAMAM表面有4個末端氨基，因此G0－PAMAM－FA的平均接枝率約為31%.

圖4 G0－PAMAM－FA化合物的紫外吸收譜圖Fig.4 UV－spectra of G0－PAMAM－FA at different concentrations

圖5 G1－PAMAM－FA化合物的紫外吸收譜圖Fig.5 UV－spectra of G1－PAMAM－FA at different concentrations

圖6 G2－PAMAM－FA化合物的紫外吸收譜圖Fig.6 UV－spectra of G2－PAMAM－FA at different concentrations

圖7 G3－PAMAM－FA化合物的紫外吸收譜圖Fig.7 UV－spectra of G3－PAMAM－FA at different concentrations

圖8 G4－PAMAM－FA化合物的紫外吸收譜圖Fig.8 UV－spectra of G4－PAMAM－FA at different concentrations

依此類推計算可知，G1－PAMAM－FA的平均接枝率約為28%，G2－PAMAM－FA的平均接枝率約為36%，G3－PAMAM－FA的接枝率約為15%，而G4－PAMAM－FA的接枝率大約為10%.第3代和4代樹形分子的葉酸接枝率較低的原因可能是由于樹形分子表面基團增多，空間位阻增大，同時接上部分葉酸分子后空間位阻效應進一步變大，阻礙了其他氨基與葉酸分子的反應.

3 結 語

PAMAM樹形大分子作為一種優良的載體廣泛用于藥物控制釋放，而引入具有腫瘤靶向功能的葉酸分子作為靶向單元可以提高藥物分子對腫瘤細胞的選擇性.本文對乙二胺為核的PAMAM樹形大分子進行葉酸接枝修飾研究.通過一系列的反應，成功將葉酸分子接枝到樹形大分子，并對所合成的系列樹形分子－葉酸化合物進行了表征.我們期望這種具有靶向性的藥物載體能夠在癌癥治療中得到更廣泛的應用.

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