高碘促成纖維細胞增殖作用與成纖維細胞生長因子及其受體的關系

華淺近， 祖茂衡， 滕 飛， 王 磊， 胡 琳

我國布加-綜合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）以下腔靜脈和（或）肝靜脈開口處隔膜阻塞型為主，其特征是下腔靜脈和（或）肝靜脈開口處隔膜形成，而隔膜的形成機制至今尚未明確［1］。病理學研究發現成纖維細胞為該隔膜主要構成成分之一，隔膜組織中成纖維細胞生長因子受體 （fibroblast growth factor receptor，FGFR）的表達明顯高于正常血管壁組織［2］。此外，國內流行病學研究發現BCS的發病率與飲用水中碘含量呈正相關［3］，同時一定濃度的高碘培養環境能促進成纖維細胞、血管內皮細胞增殖［4-5］。

本研究以CCK-8檢測法［6］檢測FGFR抑制劑SU5402與適宜濃度碘離子共同作用下成纖維細胞的增殖情況，應用免疫印跡法檢測不同濃度碘離子培養環境中成纖維細胞的堿性成纖維細胞生長因子 （basic fibroblast growth factor，bFGF）、FGFR2 蛋白表達的情況，探討高碘促成纖維細胞增殖作用與bFGF、FGFR2的關系及與下腔靜脈隔膜形成的相關性。

1 材料與方法

1.1 細胞株培養

HFL1人肺成纖維細胞（目錄號GNHu28）購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。細胞培養于Corning培養皿中，采用F12K培養基（Sigma公司），加10%胎牛血清 （Gibco公司）。于37℃、5%CO2條件的培養箱中靜置培養，至細胞貼壁生長匯合即可傳代，每周傳代2次，選取第5～6代細胞用于實驗。

1.2 細胞增殖檢測

取對數生長期的成纖維細胞，胰酶消化后制成細胞懸液，用細胞計數板作細胞計數，測定細胞密度，再用培養基稀釋至5×104個/ml。將細胞懸液接種至96孔板中，每孔約5 000個細胞，分為5組：①空白對照組 （每孔100 μl細胞懸液，20 μl F12K培養基）； ② 溶媒組 （每孔 100 μl細胞懸液，19 μl F12K 培養基，1 μl DMSO）； ③ KI組 （每孔 100 μl細胞懸液，15 μl F12K 培養基，5 μl KI）；④ SU5402組（每孔 100 μl細胞懸液，15 μl F12K 培養基，5 μl SU5402）；⑤ SU5402 和 KI共同作用組（每孔 100 μl細胞懸液，10 μl F12K 培養基，5 μl SU5402，5 μl KI）。以上各組均設6個復孔，其中③、⑤組的碘終濃度為1 000 μg/L，④、⑤組的SU5402終濃度為100 μmol/L。 隨后于 37℃、5%CO2條件的培養箱中靜置培養16 h，更換新的F12K培養基，每孔再加入CCK-8 工作液（日本同仁）10 μl，孵育 40 min。 以F12K培養基加CCK-8工作液孔作為本底調零，于450 nmol/L波長處測定各孔吸光度（A）值，間接反映細胞數量，各組A值去除1個最高值和1個最低值。以上實驗重復3次。

1.3 bFGF、FGFR2蛋白表達

取對數生長期成纖維細胞1∶6傳代，培養48 h后換液，設空白對照組和碘離子組。空白對照組直接用F12K培養基培養。碘離子組：在F12K培養基中分別加入碘化鉀，使碘離子終濃度分別為 250、500、1 000、2 000 和 3 000 μg/L，再將細胞置于培養箱中孵育12 h。采用Western印跡法檢測bFGF、FGFR2蛋白表達。用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法測蛋白濃度、SDS-PAGE電泳、轉膜和免疫反應。bFGF、FGFR2一抗（Abcam公司）均以1∶500稀釋，二抗稀釋比均為1∶1 000。顯色方法為5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/氯化硝基四氮唑藍（BCIP/NBT）發色顯色法。以上條帶均以β-actin作為內參照。掃描后采用IPP6.0圖像分析軟件對特異性條帶進行半定量分析，以 bFGF/β-acting，FGFR2/βacting的灰度值比值評定bFGF及FGFR2的蛋白表達水平。以上實驗重復3次。

1.4 統計學分析

采用SPSS16.0軟件進行統計學分析。檢測結果以均數±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多個實驗組與1個對照組比較采用最小顯著差法（LSD），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FGFR抑制劑對成纖維細胞增殖的影響

空白對照組 （1.06±0.13） 與溶媒組 （1.02±0.11）間細胞增殖率差異無統計學意義（P＞0.05）。KI組 （1.73±0.09）細胞增殖率明顯高于對照組，SU5402組（0.40±0.12）細胞增殖率明顯低于對照組，SU5402和KI共同作用組（1.18±0.10）細胞增殖率高于對照組，但低于KI組，差異均有統計學意義（P ＜ 0.05）。

2.2 不同碘濃度對bFGF、FGFR2蛋白表達的影響

各碘濃度組與空白對照組比較，bFGF蛋白相對表達量差無統計學意義（P＞0.05）。500和1 000 μg/L碘濃度組FGFR2蛋白相對表達量較空白對照組明顯提高，且1 000 μg/L組明顯高于500 μg/L組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1、圖1～3。

表1 不同濃度碘環境中bFGF、FGFR2蛋白相對表達量

圖1 bFGF、FGFR2蛋白在各組中的表達

圖2 不同碘濃度對bFGF蛋白相對表達量的影響

圖3 不同碘濃度對FGFR蛋白相對表達量的影響

3 討論

3.1 高碘促成纖維細胞增殖的作用途徑

國內流行病學調查顯示，隔膜型BCS患者分布地區的飲用水中碘含量超過正常標準，并且BCS患者尿碘高于正常人，同時一定濃度的碘能促進成纖維細胞增殖［5］。bFGF是FGF家族中最具代表性的成員，它作為重要的促有絲分裂原對成纖維細胞有明顯的促增殖作用，能趨化血管內膜的各類細胞并促進其增殖和遷移，在損傷修復過程促進細胞膠原酶的產生從而加速膠原分解，并通過促進基底膜纖維的重新排布使基質層纖維有序排布，達到減少瘢痕形成的作用［7］。FGFR是一類穿膜的酪氨酸激酶受體，介導FGF信號傳遞入細胞，分1～6個亞型，其中FGFR1、2為bFGF高親和力受體。FGF/FGFR途徑在細胞增殖和分化、創傷愈合和腫瘤細胞的分裂增殖中起重要作用［8］。

本研究用的 SU5402是 2-［（1-2-二氫-2-氧代-3H-吲哚-3-亞基）甲基］-4-甲基-1H-吡咯-3-丙酸，能靶向作用于FGFRl激酶結構域鉸鏈區的ATP結合位點，由于FGFR之間的結構和序列相似，可通過與ATP結合而抑制FGFR2的磷酸化，從而也抑制FGFR2的活性［9-10］。本文結果顯示，KI組細胞增殖率明顯高于對照組，與劉小琴等［5］發現的碘離子濃度 ≤3 000 μg/L具有促進成纖維細胞增殖和抑制細胞凋亡作用的結果相符。而對于高碘促進成纖維細胞增殖的機制少見報道。騰飛等［11］在體外以高碘環境培養血管內皮細胞，發現碘離子促進血管內皮細胞增殖并非通過提高血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體（VEGFR）的蛋白表達量實現，同時發現高碘能刺激血管內皮細胞膜受體VEGFR-2（Tyr1214）磷酸化水平上調而介導血管內皮細胞遷移。血管內皮細胞和成纖維細胞均為BCS隔膜的主要成分，高碘培養環境能引起兩者的增殖，本研究以高碘對BCS隔膜另一主要成分的成纖維細胞增殖機制為切入點進行研究，結果顯示SU5402組細胞增殖率明顯低于對照組，表明成纖維細胞增殖依賴于FGFR1和（或）FGFR2作用。SU5402聯合KI共同作用組細胞增殖率低于KI組，但仍高于對照組，表明高碘對成纖維細胞的促增殖作用不僅通過對FGF/FGFR途徑刺激實現，還通過其他途徑實現，具體機制有待進一步研究。

3.2 高碘與bFGF、FGFR2蛋白表達的關系及意義

FGFR2是bFGF的高親和力受體，在bFGF促進細胞增殖和遷移過程中起至關重要的作用［7］。FGFR2與多種腫瘤的發生發展密切相關，而被認為是腫瘤治療的重要靶點，但其在血管內隔膜形成過程中的作用尚少見報道。

本研究的Western印跡結果顯示，碘濃度500和1 000 μg/L組的FGFR2蛋白表達明顯提高，且1 000 μg/L組明顯高于 500 μg/L組，提示高碘離子能促進成纖維細胞FGFR2蛋白表達且呈濃度相關性。碘離子對成纖維細胞的增殖和凋亡具有雙向效應，較低濃度的碘離子對成纖維細胞增殖起明顯的促進作用，隨著碘離子濃度的升高促進作用逐漸消失，碘離子濃度較高時成纖維細胞增殖活性受到抑制，高碘對成纖維細胞的作用呈現出劑量-效應關系［5］，本研究發現碘濃度 2 000 和 3 000 μg/L 組的FGFR2蛋白表達低于500和1 000 μg/L組，與空白對照組無明顯差異，說明高碘對成纖維細胞FGFR2蛋白表達的影響也存在劑量-效應關系。bFGF通過與其低親和力受體硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）結合，再通過HSPG結合到FGFR上。研究表明，2個FGFR2蛋白分子與1個HSPG分子結合，FGFR2的Y657位點發生二聚化，并發生自磷酸化而活化形成穩定的二聚體［12］。FGFR2活化后可磷酸化成纖維細胞生長因子受體底物 2（FRS2）［13］，募集生長因子受體結合蛋白2（GRB2），而后激活蛋白激酶C（protein kirmse C，PKC）、Ras/Raf/MEK/ERK 等信號轉導途徑，通過細胞信號轉導通路的活化而參與調控細胞增殖、分化等生物學功能。FGFR2蛋白表達量的提高將強化上述作用過程，導致包括成纖維細胞在內的多種細胞增殖條件發生紊亂，刺激細胞內的多種信號轉導通路［14］。因此，高碘可能通過上調FGFR2蛋白表達量對成纖維細胞產生促增殖作用，而具體作用機制和激活的信號轉導通路還需深入研究。各碘濃度組成纖維細胞bFGF蛋白表達量無明顯差異，提示高碘促成纖維細胞增殖作用并非通過提高bFGF蛋白表達量實現，高碘對HSPG、FRS2、GRB2蛋白表達及對bFGF降解膠原作用是否有影響還需進一步證實。

3.3 高碘與BCS隔膜組織形成的相關性

目前研究發現，我國隔膜型BCS病例的地理分布和水源性高碘地區分布基本相符，并且患者尿碘水平明顯高于正常人［3］，這些研究均證實了BCS患者體內外的高碘環境。近年發現高碘能刺激BCS隔膜主要成分之一的內皮細胞膜受體VEGFR-2（Tyr1214）磷酸化水平上調而介導肌動蛋白重塑、張力纖維形成及VEC遷移。本研究發現，高碘因素可提高FGFR2蛋白表達量并促進其增殖，這與BCS隔膜組織檢測到增殖的成纖維細胞、高表達的FGFR結果相一致。我們推測由于肝靜脈開口處的血流切應力、膈肌損傷等因素引起了肝靜脈開口處血管壁損傷［15］，暴露出內皮下層的血管內皮細胞、成纖維細胞，而患者血液中高碘因素引起損傷處血管內皮細胞、成纖維細胞增殖及血管內皮細胞向管腔內遷移，促進BCS隔膜的形成。

然而，不同類型BCS的發病機制不同，本研究主要針對隔膜阻塞型BCS的隔膜形成機制，而不能解釋以肝靜脈血栓、閉塞、狹窄形成為特點的單純肝靜脈病變型BCS發病機制，單純肝靜脈病變型BCS發病機制的研究主要針對血栓形成原因，如JAK2-V617F基因突變、凝血因子Ⅴ基因G1691A突變、紅細胞增多癥等［1］。此外，在體外高碘環境單一培養成纖維細胞無法模擬出動態變化的人體血液內環境及隔膜的多種細胞及組織成分，本研究發現了高碘能上調FGFR2蛋白表達量，但具體作用機制和所激活的下游信號轉導通路還需深入研究。

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