溴氰菊酯對多刺裸腹溞急性毒性及解毒代謝的影響

彭 方 王 茜 王 蘭

(山西大學生命科學學院, 太原 030006)

溴氰菊酯(Deltamethrin, DM)屬常用擬除蟲菊酯類殺蟲劑, 由于其低毒性和易分解性, 目前被廣泛應用于農業蟲害的控制[1,2]。由于雨水、河流的沖刷, DM會隨水流進入江河、湖泊。雖然這種農藥最初被認為是無毒的, 但是目前大量研究證明了它的毒性[3—6]。因此, 溴氰菊酯在水環境中的殘留量以及對水生生物的毒性作用已經成為許多研究者關注的熱點。

Iqbal Sayeed, et al.[7]用溴氰菊酯染毒淡水魚(Channa punctatus Bloch), 結果發現溴氰菊酯可以引起其鰓、肝胰腺和腎組織脂質過氧化酶水平的升高。胡瓊予等[8]研究了溴氰菊酯對鯽魚(Carassius auratus)的毒性效應, 結果發現DM 會對鯽魚谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)和谷胱甘肽硫轉移酶(Glutathione S-transferase, GST)活性產生影響, 并且會引起蛋白質和DNA的交聯反應。研究表明[9,10], 溴氰菊酯對水生生物的毒性為高毒, 特別是浮游生物, 其對溴氰菊酯的敏感性順序依次為枝角類>橈足類>原生動物>輪蟲[11]。 多刺裸腹 溞隸屬于節肢動物門、甲殼綱、枝角類, 生活周期短、易采集、分布廣、實驗室條件下可進行穩定的孤雌生殖[12,13]。本實驗選用太原市的優勢種群多刺裸腹 溞(Moina macrocopa)作為實驗材料, 通過研究溴氰菊酯脅迫對其急性毒性, 體內丙二醛(MDA)含量及3種解毒代謝酶(細胞色素P450、GST和GPX)活力的影響, 分析溴氰菊酯對枝角類的毒性作用,并篩選靈敏的生化指標用于反映水環境中DM的污染狀況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

多刺裸腹 溞(以下簡稱“裸腹溞”), 采自山西省太原市小店區二里河, 在實驗室 20—25℃水溫條件下培養,經過三代以上孤雌生殖, 敏感度測試達到了中華人民共和國國家標準《水質、物質對 溞類(大型溞)急性毒性測定方法》(GB/T13266-91)[14]。實驗用為1 日齡幼 溞。

1.2 實驗試劑

溴氰菊酯(濃度：25 g/L)為南京紅太陽有限公司生產的乳油制劑, 根據其有效成分用蒸餾水配制成農藥儲備液, 實驗時將儲備液稀釋成所需的不同濃度使用。細胞色素P450酶系總活性熒光定量檢測試劑盒購自上海杰美基因試劑公司。MDA、GPX、GST和考馬斯亮藍試劑盒購自南京建成生物公司。

1.3 實驗儀器

多功能酶標儀(SpectraMax M5, California, USA)、恒溫金屬浴(CHB100, CHNIA)、電子分析天平(Model ESJ120-4)、冷凍離心機(Thermo Scientific Jouan MR23i)、?80℃低溫冰箱(Thermo, Fofma 702 Series, USA)。

1.4 實驗設計

急性毒性 選取生長狀況良好的強壯1 日齡幼 溞,分別接種到盛有不同濃度溴氰菊酯(0、0.006、0.013、0.025、0.050、0.100 μg/L)溶液的燒杯(250 mL)中, 每個燒杯10只, 設三組平行三次重復, 24、48h后按心臟停止跳動為裸腹 溞死亡終點, 分別統計各濃度組的死亡率。

酶活的測定 根據溴氰菊酯對多刺裸腹 溞24h半致死濃度(LC50)1/32、1/16、1/8、1/4和1/2, 設置5個溴氰菊酯濃度組和對照組, 處理時間為12h和24h。選取同一條件下培養的 1 日齡幼 溞同一時間進行染毒, 設三組平行三次重復, 染毒處理完畢后, 使用200 目濾網將水溞過濾, 雙蒸水迅速清洗殘留毒液, 用濾紙吸干多余水分,放入1.5 mL的EP管后置于液氮罐中。取樣完畢后將液氮罐中的材料放入?80℃冰箱保存。實驗時加入 pH 7.2 PBS溶液冰凍勻漿, 勻漿液經4℃ 3500 g 離心10min后取上清, 待測。 采用TBA顯色法測定丙二醛(MDA)含量,熒光法定量測定樣品中細胞色素 P450酶系總活性(CYP-ECOD)活性, CDNB法測定GST活性, DNTB法測定GPX活性, 蛋白質含量采用 Bradford方法[15], 以牛血清白蛋白為標準蛋白。利用美國 MD公司 SpectraMax M5酶標儀進行活力和含量的測定。

1.5 數據處理

24h和 48h LC50采用概率單位法進行數據處理。SPSS16.0統計分析軟件對實驗數據進行分析, 結果采用單因素方差分析(One-Way ANOVA), 并應用 Dunnett 法將處理組和對照組進行比較分析,與對照組比較, P<0.05為差異顯著, P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 溴氰菊酯對多刺裸腹溞的急性毒性試驗

實驗觀察發現, 不同濃度(0、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00 μg/L)溴 氰菊酯染毒多刺裸腹 溞24h、48h后, 溞體的死亡率表現出隨處理濃度的增大及處理時間的延長而增加的趨勢。在 實驗中觀察到多刺裸腹 溞中毒癥狀主要表現為：游動緩慢、外殼膨脹發白、觸角擺動變慢。通過概率單位法求得溴氰菊酯對多刺裸腹 溞24h、48h LC50分別為0.210、0.184 μg/L(表 1)。

2.2 溴氰菊酯對多刺裸腹溞脂質過氧化水平的影響

隨著溴氰菊酯處理濃度和時間的增加, MDA含量也隨之升高(圖1)。在12、24h, 濃度為0.006 μg/L時, MDA含量較對照組無明顯變化(P>0.05)。在0.013—0.100 μg/L各個濃度組處理 12、24h后, MDA含量均顯著上升(P<0.05)。其中, 0.100 μg/L濃度組處理24h后, 機體MDA含量上升至最大值, 與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.3 溴氰菊酯對多刺裸腹溞CYP-ECOD的影響

溴氰菊酯染毒后, 各處理組CYP-ECOD活性受到不同程度的影響(圖2)。當DM濃度為0.006 μg/L, 處理12、24h后, CYP-ECOD活性較正常組開始顯著升高(P<0.05),當濃度升高為 0.013 μg/L, 兩個時間段 CYP-ECOD活性較對照組極顯著升高(P<0.01)。隨著染毒濃度和處理時間的增加, 在濃度為 0.100 μg/L, 染毒 12h后, CYP-ECOD較對照組無顯著差異(P>0.05), CYP-ECOD活性恢復到正常組水平。

2.4 溴氰菊酯對多刺裸腹 溞GST活力的影響

在不同濃度溴氰菊酯作用后, GST活力呈現低促高抑的變化規律(圖3)。0.006 μg/L濃度處理12、24h, 裸腹溞 GST活力較對照組顯著上升(P<0.05)。0.013—0.050 μg/L各個濃度組處理12、24h, GST活力極顯著上升(P<0.01)。而DM濃度升高為0.100 μg/L, 處理24h后, GST活力較對照組顯著降低(P<0.05)。

表1 溴氰菊酯對多刺裸腹溞24h、48h LC50Tab. 1 LC50 of deltamethrin for Moina macrocopa in 24 and 48 hours

圖1 溴氰菊酯對多刺裸腹 溞MDA含量的影響Fig. 1 Effects of Deltamethrin on MDA contention in M. macrocopa

圖2 溴氰菊酯對多刺裸腹 溞CYP-ECOD活性的影響Fig. 2 Effects of Deltamethrin on CYP-ECOD activity in M.macrocopa

2.5 溴氰菊酯對多刺裸腹溞GPX活力的影響

在低濃度溴氰菊酯0.006、0.013 μg/L 處理裸腹 溞12、24h 后, GPX活力隨著濃度的增加與正常組相比有升高的趨勢(圖 4), 0.025 μg/L 濃度處理 12、24h 和 0.050 μg/L處理12h后, GPX活力表現為極顯著上升(P<0.01), 但當溴氰菊酯濃度升高為0.100 μg/L時, GPX活力較對照組極顯著下降(P<0.01)。

圖3 溴氰菊酯對多刺裸腹 溞GST活性的影響Fig. 3 Effects of Deltamethrin on GST activity in M. macrocopa

圖4 溴氰菊酯對多刺裸腹 溞GPX活性的影響Fig. 4 Effects of Deltamethrin on GPX activity in M. macrocopa

3 討論

3.1 溴氰菊酯對多刺裸腹 溞的急性毒性

通過溴氰菊酯對多刺裸腹 溞的急性毒性實驗, 測得其對裸腹 溞24、48h LC50分別為0.210和0.184 μg/L。當多刺裸腹 溞暴露于較低濃度溴氰菊酯溶液中, 表現出四處游動, 試圖離開燒杯, 而隨著暴露濃度和時間的增加,裸腹 溞游動變得遲緩, 活動明顯受到抑制。其原因可能是化合物對生物體的毒性大小受污染物在體內積累量的影響, 也有可能是農藥在生物體內代謝成活性更高的毒物,從而導致正常的生物機體活動受到影響。

3.2 溴氰菊酯對多刺裸腹 溞脂質過氧化水平的影響

溴氰菊酯在機體代謝過程中可能產生活性氧、自由基等物質, 這些物質攻擊生物膜系統中多聚不飽和脂肪酸而誘導機體發生脂質過氧化反應, 并生成終產物MDA。因此, MDA含量可以間接反映機體的氧化損傷程度[16]。在本實驗中, 當溴氰菊酯濃度為 0.006 μg/L時,MDA含量較對照組無顯著差異(P>0.05), 而0.013—0.100 μg/L各濃度組MDA含量均顯著升高(P<0.05), 且隨溴氰菊酯濃度增加呈逐漸升高的趨勢。機體清除自由基的抗氧化能力和氧化劑之間的平衡決定著MDA的生成量[7], 而其代謝溴氰菊酯的過程中產生了大量的自由基等氧化物質, 這些物質打破了上述平衡, 導致自由基的大暴發, 從而引起機體的脂質過氧化, 并且其損傷程度隨毒物濃度的升高而增加。在0.100μg/L高濃度處理組, MDA含量達到最大值, 較對照組差異極顯著(P<0.01), 表明機體氧化損傷嚴重。濃度為 0.006μg/L的溴氰菊酯并未引起MDA含量的顯著升高(P>0.05), 表明此濃度機體脂質過氧化水平較低, 0.013 μg/L以上濃度機體即表現出明顯的劑量效應關系, 證明多刺裸腹 溞對溴氰菊酯的敏感性較高。因此,MDA 含量可以靈敏反應農藥對多刺裸腹 溞的氧化損傷的程度。

3.3 溴氰菊酯對多刺裸腹溞解毒代謝指標的影響

擬除蟲菊酯類物質進入機體, 細胞色素P450酶系首先發揮作用, 插入一個氧原子到疏水性分子, 使它們變得有活性或者具有親水性, 但是此過程中可能會產生超氧化物, 超氧陰離子或者, 這些物質可被GST和GPX代謝。因此, CYP450是參與機體解毒代謝第一階段的重要酶[18,19]。實驗結果顯示, 當低濃度溴氰菊酯0.006、0.013 μg/L 處理多刺裸腹 溞后, CYP-ECOD活性被顯著誘導(P<0.05), 此為機體產生的應激反應, 一方面可能是溴氰菊酯代謝產生的活性氧、自由基不斷增加, 已合成的P450活性被誘導; 另一方面, P450某些基因轉錄被激活, 導致其合成效率顯著升高[17]。在 0.050 μg/L處理24h和0.100 μg/L處理12h后, CYP-ECOD活性較對照組無顯著差異(P>0.05), 可能是由于 P450酶系包括許多家族和亞家族, 其功能有相同也有不同[20], 其中多種亞家族酶都具有 CYP-ECOD活性, 一種或幾種酶表達受到影響, 其他同工酶可繼續發揮類似的催化活性。CYP-ECOD活性具體由P450酶系中的哪些亞家族提供, 目前尚不清楚, 還有待于進一步研究證實。

在本實驗中, GST在低濃度溴氰菊酯的誘導下活性升高, 而隨著濃度的升高, 其活性顯著降低(P<0.05)。本結果與溴氰菊酯脅迫后對羅非魚(Oreochromis aureus)GST的動態變化趨勢一致[21]。在12、24h, 0.006—0.050 μg/L各個濃度處理組, GST活力顯著升高(P<0.01), 表明低濃度溴氰菊酯會誘導機體產生 GST, 主要用于催化谷胱甘肽與P450代謝過程中產生的自由基、過氧化物等發生反應, 通過清除這些物質以減少與細胞內生物大分子結合的可能性, 保護機體免受氧化損傷[21]。0.100 μg/L高濃度處理裸腹 溞24h后, GST活力較對照組顯著降低(P<0.05),表明代謝產生的活性氧(ROS)等氧化物質已不能被機體及時清除, 其累積毒性嚴重抑制了 GST的功能和合成,裸腹溞解毒代謝功能明顯下降。但Kostaropoulos, et al.[22]在研究農藥對昆蟲的毒性作用時發現：GST分子是作為一種結合蛋白與擬除蟲菊酯結合, 以降低對參與解毒代謝的酶的毒性作用, 所以認為 GST是通過一種隔離的機制增加機體的防御功能。然而, GST這兩種機制在多次裸腹 溞中還有待于證實。就本實驗結果而言, GST較適于作為水環境溴氰菊酯污染的監測指標。

GPX是生物機體內解毒代謝第二階段另一種重要的抗氧化酶, 可催化H2O2轉變為H2O或使脂質過氧化物還原為正常狀態, 以防止細胞膜和其他生物組織受到破壞[23]。實驗結果表明, 在12、24h, 溴氰菊酯濃度為0.013、0.025 μg/L時, GPX活性較對照組顯著增強(P<0.05), 說明低濃度溴氰菊酯作后, GPX活性被激活, 溴氰菊酯代謝產生的 H2O2、脂質過氧化物等被清除, 避免機體受到氧化損傷; 隨著濃度的增大, 溴氰菊酯的累積毒性增加, 機體產生的大量H2O2、自由基等不能被及時清除, GPX結構可能遭到破壞, 而新生的 GPX又難以合成, 致使在0.100 μg/L濃度組, GPX活力迅速降至正常范圍以下(P<0.01)。在整個處理過程中GPX呈現低濃度促進高濃度抑制的毒理學效應。

總之通過實驗發現 GST和 GPX在溴氰菊酯脅迫后活性都有明顯的變化, 可以靈敏反應其毒性作用。因此認為, GST和GPX適于作為監測水環境中溴氰菊酯污染的生化指標。同時, 本研究結果可為構建生物監測模型提供前期的理論基礎。