血卵渦鞭蟲核糖體18S rDNA和ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列測定與系統發育分析

施 慧 謝建軍 王庚申 許文軍

(浙江省海洋水產研究所, 浙江海洋學院海洋與漁業研究所, 浙江省海水增養殖重點實驗室, 舟山 316100)

血卵渦鞭蟲是一類寄生性的原生動物, 是近年來引起三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、“牛奶病”及鋸緣青蟹(Scylla serrata)“黃水病”的一種主要病原, 該蟲對宿主感染時間長, 流行范圍廣、發病率、死亡率較高, 危害嚴重, 給梭子蟹和青蟹的養殖業造成了巨大的經濟損失。近年來國內已對該寄生蟲病原的生活史、形態學特征、感染途徑、診斷及防治技術等方面進行了一些初步研究工作,積累了一定的基礎信息[1]。

20世紀 90年代以來, 隨著分子標記技術的發展,DNA分子技術日益成為區分物種的有效手段。目前應用于寄生蟲分類鑒定和系統發生學研究的DNA基因主要是核糖體18S rRNA和ITS基因。由于18S rDNA基因在生物進化過程中具有高度保守性, 近年來國外學者根據18S rDNA基因序列設計引物, 運用于寄生蟲分子生物學鑒定[2—4]。ITS區域受外界環境因素的影響較小, 所受選擇壓力小, 區域序列的進化速度較其他區域快, 具有高變異性, 在物種間表現出極為廣泛的序列多態性, 可以從中獲得大量的遺傳信息, 目前 ITS序列作為非常有價值的遺傳標記被廣泛應用于寄生蟲學的分類鑒定上。本研究開展了血卵渦鞭蟲18S rDNA基因和ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因序列的擴增和測定, 經與 GenBank中相關序列多態性比對分析, 構建了血卵渦鞭蟲18S rDNA分子系統發育樹, 同時對不同宿主來源蟲體的18S rDNA 和ITS1進行了同源性分析, 從DNA水平探討了該寄生原蟲的分類地位, 為我國血卵渦鞭蟲病的分子流行病學提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 血卵渦鞭蟲樣本

初步診斷為血卵渦鞭蟲感染的病蟹來源于浙江舟山佛渡鄉養殖的三疣梭子蟹和浙江三門養殖的鋸緣青蟹,取血淋巴, 用 95%乙醇固定, 本實驗室保存, 編號為:ZHSH2006-1和ZHSH2006-2。

1.2 主要試劑

總基因組DNA提取試劑盒為Qiagen公司產品, Taq酶、dNTPs、DNA純化試劑盒均為寶生物工程(大連)有限公司產品。

1.3 血卵渦鞭蟲的PCR擴增鑒定

將固定的病蟹血淋巴樣品, 按Qiagen DNA zsol kit說明書提取總基因組 DNA, 用已建立的針對血卵渦鞭蟲的PCR快速診斷方法進行PCR擴增鑒定[8]。

1.4 病原18S rDNA和ITS1-5.8S-ITS2序列擴增

根據文獻[5—7]設計了兩對引物, 引物由生工(上海)生物工程有限公司合成, 引物序列(表1)。

表1 血卵渦鞭蟲PCR擴增用引物Tab.1 Nucleotide sequence of primers for Hematodinium sp.

18S rDNA的擴增選擇真核生物18S rDNA通用擴增引物EukA和EukB, PCR 反應條件為94℃預變性5min;94℃ 45s, 55℃ 1min, 72℃ 3min, 共 30個循環, 最后 72℃延伸10min。ITS1-5.8S-ITS2區域擴增選擇真核生物ITS通用擴增引物 ITS1和 ITS4, PCR反應條件為 95℃變性5min; 然后 94℃ 45s, 52℃ 45s, 72℃ 45s, 30個循環后, 于72℃延伸10min。PCR 反應體系均為25 μL, 其中超純水19.25 μL, 10× Reaction buffer 2.5 μL, 引物(50 pmol/L) 0.5 μL,dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL, 模板 2.5 μL, Taq 酶 0.25 μL。PCR產物經UNIQ-10 柱式膠回收試劑盒純化后, 寄生工(上海)生物工程有限公司進行序列測定。

1.5 18S rDNA和ITS1序列分析

利用NCBI在線BLAST程序, 對本次獲取的基因序列進行比對分析。將獲取的18S rDNA和ITS1基因序列用DNAMAN軟件進行排序、比對并輔以人工校正, 同時應用NCBI中在線軟件BLAST對獲得的基因序列進行同源檢索。從 GenBank中取得相關血卵渦鞭蟲類的序列作參考(表2), 使用MEGA 3.1分析軟件, Kimura-2法計算遺傳距離, 并采用bootstrap(重復次數1000)檢查聚類樹各分支置信度, 鄰接法(Neighbor Joining, NJ)構建分子發育樹。

2 結果

2.1 病蟹血淋巴液顯微鏡檢

病蟹血淋巴中的無顆粒細胞、小顆粒細胞和顆粒細胞3種血淋巴細胞的量較正常蟹的急劇下降, 代之以大量寄生原蟲。從不同病蟹的血淋巴液中可觀察到不同發育階段的蟲體, 多數呈卵圓型, 單核或多核, 大小約 5—10 μm不等, 仔細觀察, 有些可見2根長度不等的鞭毛(圖1)。

2.2 血卵渦鞭蟲的PCR鑒定結果

以提取的總基因組為模板, 用血卵渦鞭蟲的特異性引物從實驗樣本中成功擴增出 580 bp左右的特異條帶,其瓊脂糖凝膠電泳結果(圖2)。

2.3 血卵渦鞭蟲的rDNA基因序列比較分析

兩株蟲體的 rDNA基因序列與血卵渦鞭蟲屬的序列同源性最高, 經比對ZHSH2006-1和ZHSH2006-2的18S rDNA基因序列同源性為99.55%, 兩者與 GenBank中登錄的 FJ834441的同源性為 99.5%。上述結果表明, 所獲的序列確屬擬測定的目標片段。從 GenBank中下載來源于海水和海水甲殼類的腰鞭毛蟲相關序列, 用 MEGA3.1軟件建立系統進化樹(圖 3)。從進化樹可見, 所有收集的血卵渦鞭蟲都起源于共同的祖先, 所有序列分為兩個集群, 血卵渦鞭蟲與其他Syndinida目的蟲體處于同一集群中, 又與 8株來自不同十足目的血卵渦鞭蟲聚為 Hema-todinium sp.分支, 同時顯示與分離自 Liocarcinus depurator和藍蟹(Callinectes sapidus)的血卵渦鞭蟲親緣關系更加密切。

表2 血卵渦鞭蟲核糖體18S rDNA和ITS1基因序列來源Tab. 2 Origins of 18S rDNA and ITS1 gene sequences of Hematodinium ribosome

圖1 發病蟹血淋巴中的血卵渦鞭蟲 (1000×)Fig. 1 Hematodinium sp. from hemolymph of diseased crab

本次獲得的 ZHSH 2006-1株和 ZHSH2006-2株 ITS1-5.8S-ITS2基因片段同源性為 100%, 大小為888 bp, 包括全部ITS1(344 bp)、5.8S rDNA(150 bp)和ITS2(394 bp)(GenBank登錄號: JQ692310、JQ928405)。將獲得的 18S rDNA和ITS1部分基因分別與GenBank中已有血卵渦鞭蟲的相應序列用 DNAStar軟件進行比較分析。從18S rDNA同源性分析來看, 不同宿主來源蟲體之間差異很小, 蟲株ZHSH2006-1和ZHSH2006-2的18S rDNA序列與其他血卵渦鞭蟲的18S rDNA序列同源性達99.2%以上(表3); 但不同宿主來源蟲體ITS1進化速度較快, 獲得的ITS1序列與其他登錄的序列比對有明顯差異, 同源性高低不等(表 4)。而獲得的 5.8S rDNA-ITS2 基因序列在 GenBank中未找到相關的序列(圖4)。

圖2 血卵渦鞭蟲 PCR擴增產物瓊脂糖電泳結果Fig. 2 Sensitivity of PCR assay for detection of Hematodinium sp.

3 討論

血卵渦鞭蟲(Hematodinium)隸屬于植鞭動物門(phylum Sarcomastigophora)、腰鞭蟲綱(order DinoflagelIida)、Syndiniceae科、Syndinida目、血卵渦鞭蟲屬。自1931年Chatton, et al.[9]首次報道法國沿岸綠蟹的血卵渦鞭蟲(Hematodinium perezi)感染以來, 至今國外許多地區包括澳大利亞、阿拉斯加、蘇格蘭、加拿大以及美國東部沿岸等地均發現和報道了該寄生蟲病的流行, 該病的流行已威脅到挪威龍蝦(Nephrops norvegicus)、藍蟹、白氏雪蟹(Chionoecetes bairdi)以及蛛雪蟹(Chionoecetes opilio)等許多重要經濟甲殼類的漁業生產[10—18]。目前國外有不少來自十足目種類血卵渦鞭蟲基因片段的 18S rDNA 核酸序列已經確定[19—21], 但目前這部分工作尚不完善。國內自2006年首次報道養殖梭子蟹血卵渦鞭蟲感染以來, 已相繼在鋸緣青蟹、日本 蟳和脊尾白蝦中發現該寄生蟲感染, 但目前為止還沒有血卵渦鞭蟲18S rDNA核酸全序列的報道, ITS區域也只對部分的ITS1序列進行了比對分析[22]。

ITS是核糖體DNA(rDNA)中介于18S和28S之間的內轉錄間隔區, 包括 ITS1和 ITS2兩段序列, 分別位于18S—5.8S和5.8S—28S之間。盡管ITS序列的非編碼區(ITS1和 ITS2)生物學功能目前還不是很清楚, 但越來越多的證據表明, 這 2個高度可變的區域在核糖體進化中起著重要作用[23]。雖然ITS區堿基數少, rRNA轉錄復雜,但他們沒有翻譯成有功能的蛋白質序列, 并因此進化速度較快, 具有種內變異小而種間變異大的特性。許多研究表明, ITS序列是研究寄生蟲分類鑒定及遺傳變異的理想標記[24]。目前認為18S rDNA序列這類高度保守區域可以用來進行高級類群間系統進化的比較分析, 而 ITS更適合于解決較低分類群如種間或種內不同株差異的問題。周榮瓊等[25]利用ITS1序列測定及分析發現ITS1片段可作為隱孢子蟲屬的種間鑒定種的遺傳標記。

本研究對血卵渦鞭蟲的18S rDNA和ITS序列的比對分析顯示, 屬內18S rDNA進化保守, 序列高度同源, 不同宿主來源血卵渦鞭蟲的同源性高達99.2%。獲得的兩株血卵渦鞭蟲宿主分別是三疣梭子蟹和鋸緣青蟹, 其 18S rDNA基因序列之間同源性高達 99.6%, 說明 18S rDNA序列可以用于血卵渦鞭蟲系統進化分析。將 GenBank中相關 ITS序列進行比對分析時發現, 所獲的兩個ITS1序列與 GenBank中相關 ITS1序列的同源性最高在 97.7%,最低為21.2%, 這說明感染我國梭子蟹和青蟹的血卵渦鞭蟲與國外分離獲得的血卵渦鞭蟲屬于不同基因型。同時分析結果也顯示, 來源于不同宿主的血卵渦鞭蟲的 ITS1高度特異。但獲得的兩株蟲體的ITS1序列之間同源性很高,達 100%, 這可能與宿主所處的地理位置有一定關系。Small, et al.[26]對分離自不同十足目的血卵渦鞭蟲ITS1序列測定及分析發現不同海域來源的血卵渦鞭蟲ITS1區核酸存在一定差異。另外ITS1分析結果也顯示分離自三疣梭子蟹和青蟹的血卵渦鞭蟲與國外分離自藍蟹和Liocarcinus depurator的血卵渦鞭蟲的ITS1序列同源性要明顯高于其他株系, 達 94%以上, 這可能與寄生的宿主有關, 藍蟹和Liocarcinus depurator與我國三疣梭子蟹及鋸緣青蟹雖然所產地理位置不同但都屬于梭子蟹科。本文根據以上結果初步確定血卵渦鞭蟲ITS1區核酸更適用于血卵渦鞭蟲屬內的分類學研究。目前國際上關于血卵渦鞭蟲ITS序列信息不及18S rDNA序列豐富, 本研究未根據獲得的 ITS區域構建血卵渦鞭蟲系統進化樹。GenBank中相關ITS2基因序列信息不全, 本文也未能對ITS2序列進行比對分析, ITS1與ITS2在血卵渦鞭蟲蟲株進化過程中所起的作用是否一致, 還有待進一步探討。

圖3 采用N-J法根據腰鞭毛蟲類18S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig. 3 The phylogenetic tree of dinoflagellata -like organism based on 18S rDNA gene using the Neighbor-Joining method

表3 血卵渦鞭蟲種內蟲株的18S rDNA序列同源性比較分析Tab. 3 Analysis of 18S rDNA sequence similarity between Hematodiniums

表4 血卵渦鞭蟲種內蟲株的ITS1全長序列之間同源性比較分析Tab. 4 Analysis of full-length ITS1 sequence similarity between Hematodiniums

圖4 ZHSH2006-1株和ZHSH2006-2株5.8S rDNA -ITS2序列Fig. 4 5.8S rDNA-ITS2 gene sequence of ZHSH2006-1and ZHSH2006-2 5.8S rDNA: 150 bp; ITS2: 394 bp